梨品种ssr分子身份证的构建

梨品种ssr分子身份证的构建

中国是梨的主要起源之一。梨品种丰富。许多地方品种仍然是许多梨产区的主要品种。近年来,我国梨产业获得了快速发展,新品种选育推广速度加快,大量优良品种被应用于生产传统的形态学品种鉴定方法无法高效地鉴别大量的品种。分子标记技术不受环境条件、表型、植物组织、生长发育阶段等的影响,为植物品种鉴定提供了准确、可靠的技术手段1材料和方法1.1材料表面供试124份梨种质的幼嫩叶片于2016年4月采自中国农业科学院郑州果树研究所梨资源圃(见表1)。1.2pcr扩增类试验在中国农业科学院郑州果树研究所综合实验室进行。采用改良CTAB法提取DNA从已报道PCR反应体系为20μL,含10×PCRBuffer(MgPCR反应程序如下:94℃预变性5min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸10min;10℃保存。1.3读取片段大小PCR产物送北京阅微基因技术有限公司进行毛细管电泳检测,用GenemapperIDv3.2软件(AppliedBiosystems,USA)读取片段大小。纯和位点的基因型数据记录为X/X,杂合位点的基因型数据记录为X/Y(X<Y),缺失记录为-/-。1.4sr特征的指纹数据表和分子签名的构建利用Excel软件按照薛华柏等2结果与分析2.1基因型的筛选25个SSR位点按照基因型数目从多到少可排序为Pb2L5N03978、Pb4L11N0673、Pb2LUN23926、Pb2L5N04728、Pb2L2N01186、Pb2LUN23511、Pb2L2N00842、Pb2L11N19979、Pb2L17N16340、Pb2LUN24633、Pb2L2N00685、Pb2L7N06398、Pb3LUN7415、CH03g07、Pb3L15N4181、Pb3L17N4741、Pb3L8N5448、Pb3L3N4999、Pb3L17N4804、Pb3L5N1095、Pb3LUN6569、Pb4L1N0014、Pb3LUN7727、Pb3L9N2234、Pb3L5N1305,在124个梨品种中分别有69、63、62、61、58、57、56、56、55、53、52、51、48、43、40、39、37、36、34、34、32、31、31、27、21个基因型。2.2供试引物的高多态性进一步分析发现,供试25个SSR位点中区分品种能力最强的Pb2L5N03978能够单独区分43个品种,而区分能力最弱的Pb3LUN7727、Pb3L9N2234、Pb3L5N1305等3个位点分别能够单独区分8个品种(见表3)。除了“张掖长把”和“兰州长把”,“巍山红雪梨1号”和“巍山红雪梨2号”,“火把梨”“晚熟火把梨”和“祥云火把梨”,“弥渡小红梨”和“祥云小红梨”等4组共9个品种无法区分开以外,其余115个品种可被区分。在可被区分的115个品种中,“捷1”“茄梨”“保利阿斯卡”“安梨”“大酸梨”“蜜梨”“洋红宵”“红宵梨”“八里香”“满园香”“临夏香把”“林夏窝窝果”“红金瓶”“红蓓蕾莎”“SilkRed”“它西阿木特”等16个品种必须由不同位点的SSR引物加以组合进行区分;“福安尖把”“小香水”“黄山”等其余99个品种各自至少在1个SSR位点上拥有特征基因型,仅用一对引物即可区分,充分体现了供试引物的高多态性特点。这99个品种中,“若光”“冬果梨”“大叶雪”“砀山酥梨”“库车阿木特”“花长把”“水红宵”“贵德长把”“沙伊东黑酸梨”“罗莎”等10个品种仅在1个SSR位点拥有特征基因型,另外89个品种在2个以上的SSR位点拥有唯一的特征基因型,“杜霞西”最多,在14个SSR位点拥有唯一的SSR特征基因型。2.3ssr引物筛选25个SSR位点经过排序优化后,发现可以用Pb2L5N03978、Pb4L11N0673、Pb2L2N01186、Pb2L11N19979、Pb2LUN24633、Pb2L2N00685、Pb3L8N5448、Pb3L5N1095和Pb3LUN6569等9对SSR引物将除上述“张掖长把”和“兰州长把”等4组共9个未能被区分的品种外的其余115个梨品种区分开。在这9对引物中,Pb2L5N03978首先区分了43个品种,Pb4L11N0673接着区分了41个品种,之后Pb2L2N01186区分了14个品种,Pb2L11N19979区分了4个品种,Pb2LUN24633区分了5个品种,Pb2L2N00685、Pb3L8N5448、Pb3L5N1095和Pb3LUN6569则分别区分出了2个品种(见表4)。2.4分子身份证号码根据124份梨品种的SSR特征指纹数据表所列的10个SSR位点的基因型数据,通过赋值编码生成供试品种的分子身份证号码。其中,115个能被区分的品种具有唯一的分子身份证号码,而9个未能被区分的品种(“张掖长把”和“兰州长把”;“巍山红雪梨1号”和“巍山红雪梨2号”;“火把梨”、“晚熟火把梨”和“祥云火把梨”;“弥渡小红梨”和“祥云小红梨”)共享了4个非唯一的分子身份证号码(见表5)。3品种分子身份证号码的构建本研究利用筛选的25对梨SSR核心引物对分别属于沙梨、白梨、新疆梨、西洋梨和秋子梨的124份梨品种进行分析,构建品种特征指纹数据表,并在此基础上生成品种分子身份证。25对引物区分了115份梨品种,但未能将“张掖长把”和“兰州长把”,“巍山红雪梨1号”和“巍山红雪梨2号”,“火把梨”、“晚熟火把梨”和“祥云火把梨”,“弥渡小红梨”和“祥云小红梨”等4组共9个品种区分开。这4组不能区分的品种均来源于同一地区或邻近地区,可能相互之间分别互为变异系,也可能是相同的品种在不同地区的不同表现型,相互之间遗传背景差异较小,因此,利用SSR标记难以有效区分。不过这些推测有待进一步验证。本试验中的“火把梨”是中国农业科学院郑州果树研究所早年从云南大理引入的红皮梨品种,用作亲本已经选育出“满天红”“红酥脆”“美人酥”等红皮梨新品种,但该品种是云南大理哪一种火把梨目前并不清楚。“晚熟火把梨”和“祥云火把梨”是中国农业科学院郑州果树研究所2016年从云南大理祥云县引入的火把梨自然变异系。3个火把梨品种未能被区分开,表明相互间遗传背景差异很小,“火把梨”很可能跟本课题组推测的一样,也是从祥云县引入的。陆续出版的每个果树树种的种质资源描述规范和数据标准,都在种质资源数据采集表中明确列出了“指纹图谱与分子标记”数据项,足见构建品种资源指纹工作的重要性。品种分子身份证号码将品种指纹信息数据化为一串字符,能够全面反映品种指纹信息,将有可能成为种质资源指纹图谱信息采集的“标准数据”。传统编号方法多是基于对单个等位基因进行赋值,再将等位基因赋值合并为代表该位点基因型的字符串,最后再由基因型字符串串联生成分子身份证号码。比如,按顺序对等位基因按照检测结果的有无分别用“1”和“0”来赋值后,再将所有SSR位点的数据串联起来形成“1”和“0”的矩阵文件本研究将SSR标记基因型作为整体看待并进行赋值的优点主要有两个方面。一是能够释放出直接对等位基因赋值的编号方法赋予低频率等位基因过多的编号资源。这些低频率等位基因在群体中仅存在于较少的个体基因型中,直接对等位基因赋值的编号方法实际是给这些低频率等位基因与所有其他等位基因的可能基因型组合都预留了2位字符的编号。本研究将SSR标记基因型作为整体看待,仅对检测到的基因型进行编号,节约了有限的编号资源。二是保证了编号资源在同一SSR位点所有基因型中的充分利用。当用0~9和A~Z直接对个体标记基因型的2个等位基因进行赋值时,个体标记基因型的编号由2个等位基因的赋值组合而成,会导致基因型不改变而2个等位基因“序位”互换时改变赋值(比如3、6分别代表2个等位基因,所以36和63表示的基因型都是由等位基因3