microRNA的作用规律及其在细胞生物学研究中的应用

microRNA的作用规律及其在细胞生物学研究中的应用摘要：MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22nt的非编码单链RNA分子，它参与细胞转录后基因表达调控。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。本文着重讨论了microRNA的作用规律，包括它的生成、作用模式、作用机制；及其在细胞生物学研究中的应用，包括miRNA在基因沉默、细胞周期调控、对细胞分化的作用和在信号通路中的作用及其在细胞生物学研究中的应用。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，定量测量miRNA的表达水平，可以帮助人们对其功能和作用机制的了解。关键词：miRNA；miRNA的生成；作用规律MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约20~24nt的非编码单链RNA分子，在细胞内发挥调节基因表达的作用，主要是裂解互补的mRNA或是抑制它的翻译，与许多疾病相关。它是植物、动物、病毒分子，甚至是单细胞有机体、绿藻、衣藻中的基因调控分子。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7,到目前为止，在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中已经鉴别出有4361个miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。对miRNA表达水平的定量可以帮助理解它的作用机制。miRNA在各种生物体之间具有保守性，使它的来源丰富⑴。本文着重讨论了microRNA的作用规律及其在细胞生物学研究中的应用。_、miRNA特征miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性。在各个物种间具有高度的进化保守性，并且在茎部的保守性最强，在不同组织中表达有不同类型的miRNA。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNA中发现，在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNA表达模式具有分化的位相性和时序性。miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性。同时，每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。大多数研究表明基因组中存在60-90nt的发夹结构，称为RNA发夹。miRNA转录

的前体也存在发夹结构，根据来二级结构域区分miRNA发夹序列和其他部分的发夹结构［2］。其5‘端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U,—般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。在3‘端有1~2个碱基长度变化，它不编码蛋白质，本身不具有开放读框。成熟的miRNA5‘端有一个磷酸基团，3‘端为羟基，是与相同长度的功能RNA降解片段相区分的标志。二、miRNA的作用规律l.miRNA的生成据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：在RNA聚合酶II的作用下从DNA转录一个原始内源性转录本miRNA(pri—miRNA)。由pri-miRNA生成70nt左右的miRNA前体(pre-miRNA)，该过程发生在细胞核。Pre-miRNA是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来。它是非编码RNA,具有茎-环结构。将pre-miRNA加工为成熟miRNA。该过程发生在细胞质中。Pre-miRNA在Dicer的作用下被裂解成瞬时miRNA双体。这种双链miRNA分子很快与包括Argonaute(Ago)蛋白在内的其他多种蛋白质结合，参与构成RNA诱导沉默复合物(RNA一inducedsilencingcomplex，RISC)。具体的过程是:MiRNA是在DNA聚合酶II的作用下从DNA转录miRNA基因生成pri-miRNAo生成的pri-miRNA经RNaselll-Drosha加工释放发夹中间体pre-miRNA。然后由依赖RNA的核转运受体家族成员输出蛋白-5(Exportin5)将pre-miRNA运出细胞核。到达细胞质后，pre-miRNA在RNaselllDicer的作用下进行第二次加工，pre-miRNA被裂解成瞬时miRNA双体，生成的miRNA:miRNA*双螺旋中，只有miRNA单链可以选择性结合到RNA诱导的沉默复合体。它的一条链通过未知RNA酶降解，而另一条链保留成为成熟的miRNA，参与构成RISC。］。最新的研究表明，miRNA的前体加工还存在不依赖于Dicer的其他途径，例如pre-miR-451可以形成特殊的二级结构，直接被Ago2所识别并切割加工形成成熟体miRNA⑷。2.miRNA与靶mRNA的作用模式

miRNA通过调节靶基因的表达水平影响细胞分化、增殖、凋亡等特性，在生物的生长发育和疾病发生发展中发挥重要的作用。miRNA作用通路研究表明，作用通路作用模式有：宿主基因与内含子miRNA共同抑制一个基因功能；同一个基因簇内的miRNA共同抑制两个相关的蛋白编码基因；两个宿主基因与各自的内含子miRNA基因形成双向负调节回路⑸。绝大多数miRNA通过与靶mRNA的互补配对，在转录后水平沉默基因的表达从而使细胞表型发生改变。在人基因组中已鉴定出上千个miRNA，根据软件预测，约60%基因的3'非翻译区(untranslatedregion,UTR)都有miRNA的结合位点。每个miRNA可以调控多个靶基因，而几个miRNA可协同调控同一靶基因，miRNA实现的是一种宏观而又精细的调控。RISC作用模式分为3种：以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制靶mRNA的翻译而不影响它的稳定性，此种方式在动物中多见；以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后降解靶mRNA，此种方式常出现于植物中；以let-7为代表，当与靶标基因完全互补结合时直接靶向切割mRNA，如果蝇和HeLa细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA的3’端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译［51。虽然绝大多数miRNA需要与Ago蛋白结合后才能发挥功能，但最新的研究表明，miR-328可以直接结合hnRNPE2,从而解除hnRNPE2对C/EBPmRNA的翻译抑制作用，最终促进髓系祖细胞向粒细胞的分化⑹。3.miRNA作用机制⑺除已明确的mRNA降解和衰减机制外，还陆续提出了翻译起始抑制，翻译起始后抑制，P小体(processingbody)、应激颗粒(stressgranule)颗粒扣押靶mRNA、去抑制和激活等作用。(1)miRNA抑制翻译的起始在含有m7Gppp帽子结构的mRNA，含有内部核糖体进入位点

(internalribosomeentrysite,IRES)和含有ApppN帽子结构的三种mRNA中，只有m7Gppp帽子结构的mRNA可以被miRNA抑制，说明m7Gppp的帽子结构是miRNA介导的翻译抑制是必需的。另一方面，核糖核蛋白复合体(miRNP)中聚集了某些帽子结构结合蛋白或者mRNA翻译起始过程中，干扰eIF4E-eIF4G相互作用的蛋白质，从而使40S核糖体小亚基不能结合到翻译起始复合物中。miRNA的起始后抑制科学家提出miRNA介导的抑制发生在翻译起始后的步骤，即miRNA降低了翻译延伸的速度。关于miRNA抑制翻译的起始后过程仍需要进一步的证据。miRNA与mRNA的3'UTR以外的区域结合有研究表明，miRNA还可以结合基因的编码区和5'UTR区，miRNA通过与靶基因的启动子和5'UTR区结合激活某些基因的表达。近来还有证据表明，miRNA除了调控编码基因还负调控一组非编码基因UCG的表达,UCG是人基因组中的一种非编码基因，在脊椎动物中高度保守。因此，miRNA的异常表达不仅会导致编码基因表达的失调，其非编码基因的表达也会受到影响。miRNA介导的mRNA降解与P小体有关P小体是真核细胞细胞质中的RNA颗粒体，其中富含降解mRNA的蛋白质和翻译抑制子，被认为是细胞的mRNA代谢场所。比如在肝细胞中，CAT1mRNA被肝特异性miR-122所沉默，随即聚集在P小体中，当氨基酸饥饿或者其他应激状况下，HuR蛋白可以通过促进miRISC-靶mRNA复合体解离和P小体解聚，去除miRNA的抑制作用)由细胞核进入细胞质中，与CAT1mRNA的3'UTR区结合，使CAT1mRNA由P小体中释放出来进入多核糖体进行翻译。RNA结合蛋白也可以解除miRNA对其靶基因的抑制作用。比如，miR-430在体细胞中抑制nanosl和tdrd7的表达，而在生殖细胞中却无此作用，这是因为在生殖细胞中RNA结合蛋白结合到nanos1和tdrd7的3'UTR区导致miRNA无法与之结合而致。这样，RNA结合蛋白在miRNA介导的基因表达调控中作为激活子存在。(5)miRNA可激活靶基因的表达

miRNA对靶基因可从正负两方面进行调控，miRNA激活作用与富含腺嘌吟/尿嘧啶元件(AUrichelement,ARE)相关，ARE存在于多种细胞因子，癌基因，生长因子的3PTR区，ARE是miRNA活化翻译的信号，在饥饿等环境因素影响下，可促进靶基因mRNA的降解。在miRNA指导下，miRISC复合物成员如Ago、FXRP被招募到ARE上，激活翻译、上调基因表达。(6)miRNA对靶基因的去抑制作用研究发现在鼠的神经元细胞中，miR-134抑制了limkl的表达，而当BDNF因子刺激神经元细胞时，miR-134从lim1mRNA中释放出来，解除了miR-134对lim1mRNA的抑制作用。在果蝇中，miR-280和miR-289所调控的靶基因之一是钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKlI)，在接受嗅觉刺激后，CaMKlI在突触后位点翻译被活化。Ashraf等发现这个活化翻译的过程是与armitage(RISC-miRNP复合体的解旋酶)的蛋白酶介导的蛋白质水解有关，说明CaMKlI翻译的活化是miRNA去抑制的过程。4.miRNA调控基因表达的特点部分miRNA成簇表达约有37%的miRNA基因是成簇分布在基因组中，这些基因簇中的miRNA基因有的共享同一套调节序列，来源于一个转录物；有的miRNA基因簇中的miRNA来源于独立的转录物，比如miR-433和miR-127。另外，一个miRNA基因通过双向转录还可以产生两个不同的miRNA，分别调控不同的靶基因有些基因簇中的miRNA在功能上相关的，共同靶向同一基因或者同一基因家族，或者靶向了同一条信号通路中的不同组分，同一基因簇中的miRNA调控功能上相关的蛋白质，另外，同一miRNA家族中的成员有可能有相似的功能可能参与相似的生物学过程。组织特异性miRNAmiRNA的表达有时间特异性和组织特异性。通过对人和鼠的成体器官的miRNA表达谱分析发现，约50%的miRNA是组织特异性的表达方式。对斑马鱼各组织进行原位杂交发现多数组织特异性的miRNA在发育过程中存在时间特异性。与编码蛋白质的基因一样，组织特异性的miRNA的表达也受复杂的转录因子系统

的调控，并且其调控因子往往与mRNA的调控因子是一致的。另外，组织特异性的miRNA与其转录因子形成了转录因子-miRNA的反馈调节体系，即转录因子激活miRNA表达，miRNA沉默转录因子表达的反馈体系。miRNA前体的编辑miRNA前体的编辑指的是miRNA前体的腺苷酸被腺苷酸脱氨酶编辑，经历A到I的转变，根据预测，体内16%的人pri-miRNA都经历腺苷(A)到肌苷(I)的编辑,pri-miRNA编辑的失调会导致疾病。miRNA编辑一方面控制miRNA生物发生，另一方面导致了蛋白质功能的多样性，以此更进一步对miRNA功能进行精细调节。内含子miRNA与宿主基因的协同作用miRNA分布在基因组的编码区和非编码区，其中处于基因内含子中的miRNA占所有miRNA的40%左右。内含子miRNA与其宿主基因在功能上是相互调控的，另一方面，并不是所有的宿主基因都与其内含子miRNA是相互调控的miRNA受表观遗传学调控基因间的miRNA的转录主要是由RNA聚合酶II完成，而初级转录物pri-miRNA的结构中含有与编码蛋白质的基因初级转录物相同的7-甲基鸟苷的帽子和多聚腺苷酸尾巴。并且miRNA也被DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观遗传修饰所调控的⑻。三、miRNA在细胞生物学中的应用miRNA在动植物中普遍存在，并且在动植物的生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30%的基因受miRNA调控，并且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。这使得miRNA作为调控因子，在细胞生物学中具有广泛的应用。1.利用人工microRNA实现基因沉默近年来利用人工miRNA(artifieialmieroRNA，amiRNA)的技术，实现特定基因的沉默，特别是用于共同抑制几个相关基因，这种包含一个发卡结构前体的载体也被称作第二代RNAi载体［9］。利用amiRNA实现基因沉默的作用原理，人工合成miRNA，构建转基因载体，实现对目的基因的沉默，可以指导胚胎干细胞定向分化并抑制其他谱系形成，功能性地对胚胎干细胞自我更新和分化进行调节，研究细胞信号转导通路和细胞生长分

化等。调节细胞周期miRNA对细胞周期有反馈调控作用，这种反馈调节的机制在细胞中广泛存在。曾泉等［i0］通过构建微小RNA125b真核表达载体，研究其过表达后对细胞增殖的影响。构建的真核表达载体，经质粒酶切和测序鉴定正确，转染细胞后72h经实时定量PCR检测，成熟miR—125b能有效高表达，MTT及Brdu法检测显示细胞增殖受到非常明显抑制，证明了通过过量表达miRNA，能使细胞的增殖受到抑制。调节干细胞自我更新胚胎干细胞有特异性的miRNA表达，miRNA对胚胎干细胞增殖与分化起重要的调控作用。杞少华等⑴］研究表明：miRNA对造血干细胞分化的多个阶段和方向有调控作用，miRNA还参与了神经干细胞、间充质干细胞和皮肤干细胞等成体干细胞分化的调控。干细胞特异性的miRNA可提高体细胞重编程的效率。Melton等虫］报道,miRNAlet-7抑制胚胎干细胞中的自我更新程序。这种抑制可以被一组胚胎干细胞调控型miRNA(ESCCmiRNA)逆转，说明let-7和ESCCmiRNA之间的互动提供一个能够支配细胞命运的机制。调节细胞分化miRNA调控细胞的分化是一个复杂的过程，其调控基因的方式是多对多的，也就是说，一个miRNA分子可以有多个靶基因，它可以在一个细胞里同时调控多个靶基因来影响该细胞的分化，也可以通过对不同细胞中不同的靶基因的调控使得不同的细胞执行不同的功能。这项研究对揭示miRNA途径调控干细胞行为的机制具有重要的指导意义。利用类似miRNA小分子控制细胞的方法，在未来的细胞生物学研究中将扮演重要的角色。miRNA在细胞信号转导通路中的作用近30%的信号网络蛋白为miRNA的靶。而在人类基因组中，miRNA的靶基因仅占总基因数的17%左右，这表明与其它蛋白相比，miRNA更倾向于选择信号转导通路上的蛋白为靶，因而在信号调控方面扮演更为重要的角色。此外，同配体、细胞表面受体之类的上游信号因子相比，miRNA似乎更多地以下游信号转导元件如转录因子。由此

可见，miRNA的作用是多种多样的，它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的分化转归，也可能与其靶基因产物相互作用形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。miRNA在细胞生物学研究中作为调节蛋白表达的分子，为细胞的定向反应提供了可能，因而在信号调控方面扮演更为重要的角色。而且在功能基因组研究、基因治疗方面有着广泛的应用前景。四、展望从前述的诸多信息，我们可以得出一个结论，RNA不再只是作为DNA与蛋白质之间的中介发挥作用，而是参与到了基因的表达调控、RNA的定点修饰，以及染色体的结构组织等各个方面。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。定量测量miRNA的表达水平，可以帮助人们了解人类疾病的机制和发现新的药物靶点。衡量的miRNA表达水平主要有三种方法：实时反转录聚合酶链式反应，基因芯片，新一代测序技术。这些方法不仅是适合已知的miRNA和微阵列，也能检测出未知的miRNA。微RNA谱的建立进展迅速，应用于药品开发，是一个充满希望的领域Ml。虽然微阵列分析可实现miRNA的表达谱分析，多种新型芯片和改进技术不断涌现，但微阵列分析检测的灵敏度和特异性还需进一步提高［14］。诸多数据表明miRNA在进化上从未停止，许多物种中都存在着进化上年轻的或者是物种特异的miRNAQ］。人类对miRNA的了解仍微乎其微，目前大多数研究还只是通过生物信息学方法结合miRNA已知的一些特征进行预测应用的探索。miRNA分布范围广泛，参与的生物学过程复杂，调控的靶基因众多。因此，研究miRNA的功能及作用机制有重要意义。存在许多新的问题：如何精确预测miRNA及其靶基因仍需要不断的探索；miRNA究竟是如何选择沉默的机制或通路；miRNA的发现只是小分子RNA研究的一部分，生物体内其他几种小分子非编码RNA的功能和作用机制还知之甚少。以上问题的解决，将帮助我们更好地理解高等真核生物基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络，有利于进一步理解miRNA在生物发展中的作用，并为利用miRNA进行临床诊断和治疗提供新的依据。随着对miRNA研究的不断深入，人们对其功能和作用机制的了解也越来越明确。但是，目前的研究仅限于miRNA在正常或疾病状态下的表达谱变化研究，miRNA在正

常组织发育和疾病发生中所发挥的具体作用机制还未见有报道。对于miRNA的研究大多还处于理论水平上，对miRNA的实际应用也并未开展。在今后的研究工作中，可以结合miR-NA的表达谱变化，通过生物信息学方法查找疾病或发育过程中表达变化明显的miRNA的靶基因，并通过过量表达和沉默技术研究特殊miRNA的功能，开展研究以拮抗miRNA为主的化学合成药物，这对以miRNA为基础的疾病诊断和治疗策略具有重要意义。参考文献MuhammadYounasKhanBarozai,MuhammadDin,IftikharAhmedBaloch,IdentificationofmicroRNAsinecologicalmodelplantMimulus[J],JournalofBiophysicalChemistry.2011,8,3(2):322-331.DangHungTran,ThoHoanPham,KenjiSatou,TuBaoHo,PredictionofhumanmicroRNAhairpinsusingonlypositivesamplelearning[J],JournalofBiomedicalScienceandEngineering,2008,8,2(1):141-146.⑶马菲菲,吕长坤，万雪莲等.microRNA研究现状[J].生物信息学.2011,9(3):201-204.⑷赵雅，吴立刚.基因表达调控多面手一一microRNA和siRNA的作用机制[J].生命科学.2010,7,7(22)628-634.⑸陈俊宇.miRNA作用通路研究[J].中山大学研究生学刊.2007，28(2):27-36.⑹秦彤，苗向阳.microRNA及其应用研究进展[J].生物技术通讯.2011,1,1(22):98-103.[7]EiringAM,HarbJG,NevianiP,etal.miR-328functionsasanRNAdecoytomodulatehnRNPEregulationofmRNAtranslationinleukemicblasts[J].Cell.2010,140(5):652-65。⑻郑永霞，焦炳华.miRNA的生物形成及调控基因表达机制[J].生命的化学.2010,30(6)821-825.⑼陈起振，张志仙,曹家树.利用人工microRNA实现基因沉默[J].中国细胞生物学学报.2011,33(4):433-438.[10]曾泉,谢小燕，赵爱华等,RNAmiR—125b真核表达载体的构建及其对细胞增殖的影响

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