补骨脂及其与甘草配伍对补骨脂酚在大鼠体内的毒性研究

补骨脂及其与甘草配伍对补骨脂酚在大鼠体内的毒性研究

补骨脂是一种常见的中药。具有加热肾、辅助阳、纳气、止泻的功效，临床应用非常详细。但近年已有一些关于补骨脂临床不良反应(肝、肾毒性)的报道配伍是中医用药的基本形式,甘草为方剂配伍应用最普遍的中药,补骨脂与甘草也经常配伍应用。中药配伍存在着复杂的相互作用,深入研究中药配伍后活性成分的毒代动力学变化,对阐明中药的配伍毒性及指导临床合理用药具有重要意义。近来研究显示甘草主要成分甘草次酸可抑制肝微粒体多种CYP450同工酶本研究比较了补骨脂单煎液及其与甘草合煎对补骨脂酚毒代动力学与毒性的影响,为深入研究补骨脂与甘草的配伍毒性提供新的科学依据。1材料表面1.1/10万电子天平/mill-q纯水器Agilent1260高效液相色谱仪(VWD检测器,二元高压梯度泵,柱温箱;美国安捷伦公司);1/10万电子天平(德国赛多利斯公司);涡旋混合器(美国ScientificIndustries公司);ThermoMicroCL21R高速冷冻离心机(美国);Milli-Q纯水器(美国);MD200-2氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)。1.2补骨脂素和脂素对总样的检测补骨脂(北京三和药业有限公司,批号100401),按《中国药典》2010年版一部检验,含补骨脂素和异补骨脂素总量为0.75%,结果达到药典要求;甘草(北京三和药业有限公司,批号40401002),按《中国药典》2010年版一部检验,含甘草苷0.54%,甘草酸1.5%,结果达到药典要求。补骨脂酚对照品(南京泽朗医药科技有限公司,纯度99%);马兜铃酸A(纯度99%)、丹参酮Ⅱ1.3实验动物及药物SPF级健康SD大鼠35只,8周龄,雌雄均有,体重约200g,购自北京大学医学部实验动物科学部,许可证号SCXK(京)2011-0012。2方法2.1动物组和剂量SD大鼠共35只,雄性25只,雌性10只,按照体重、性别将大鼠随机分为7组,溶剂(蒸馏水)对照组、甘草(20g·kg2.2单次给药中毒的代动力学研究2.2.1给药剂量的选择2010年版药典中规定成人补骨脂每日常用量为6~10g,按成人60kg体重计算,日用量为100~167mg·kg2.2.2给药体积的测定分别称取适量补骨脂、补骨脂+甘草、甘草若干,浸泡30min,水煎3次,每次于沸水中煮沸1h,再将3次药液经8层纱布过滤合并,按照给药体积(10mL·kg2.2.3标准物质和内标溶液的制备精密称取补骨脂酚对照品100mg于100mL量瓶内,甲醇溶解并稀释至刻度,得到质量浓度为1g·L2.2.4血清蛋白的检测大鼠给药后,于0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,12,24h内眦静脉取血0.5mL,肝素抗凝,4000r·min2.2.5条件1PhenomenexC2.2.6分离、测定物的测定专属性考察:分别取5只大鼠空白血浆混合样品,加入一定量的补骨脂酚对照品及内标,按照上述血浆处理方法处理后,HPLC分析。比较其色谱行为,考察内源性物质是否干扰补骨脂酚和内标物的分离、测定。线性关系考察:取大鼠空白血浆0.1mL,分别精密加入一定量的补骨脂酚对照品溶液和等量内标溶液,旋涡混匀,配成含补骨脂酚质量浓度分别为20,50,100,200,500,800,1000μg·L精密度考察:配制补骨脂酚终浓度为50,200,800μg·L提取回收率考察:配制补骨脂酚终浓度为50,200,800μg·L稳定性考察:配制补骨脂酚终浓度为50,200,800μg·L样品测定的质量控制:血浆样品的测定在分析方法验证完成之后进行,每批血浆样品测定的同时测定随行标准曲线及质控样品。2.3肾功能生化指标各组大鼠分别于单次给药24h后自内眦静脉取血1mL,置肝素化离心管中,离心后取上层血浆测定肝、肾功能生化指标,包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)及肾损伤分子1(Kim-1)水平。分别按试剂盒说明书进行操作。2.4统计学处理方法测定结果用ue0af±s表示,毒代动力学参数采用DAS2.0软件进行计算,应用SPSS16.0统计软件分析,组间均数比较采用单因素方差分析。3结果3.1中毒代理的动态变化3.1.1保留时间和保留时间对hplc图谱的影响内标与补骨脂酚完全分离且峰形良好,保留时间分别为12.35,10.21min,HPLC图谱见图1。血浆中的内源性物质不干扰补骨脂酚的测定。3.1.2线性关系和定量限用加权最小二乘法进行回归运算,权重系数w=1/X3.1.3分别实行不同的救济方式,增强对社会稳定的认识低、中、高质量浓度的血浆样品日内精密度RSD分别为4.71%,2.92%,1.90%;日间精密度RSD分别为3.97%,2.07%,1.70%,均小于15%,符合要求。3.1.4提取回收率50,200,800μg·L3.1.5稳定性研究血浆样品室温(25℃)放置4h、冷冻(-20℃)保存15d、反复冻融3次,测定的补骨脂酚RSD均小于15%。3.1.6补骨脂水提取物和补骨脂甘草联合用药的小鼠毒代动力学改变与大鼠单次给予补骨脂24h的补骨脂酚血药浓度比较,补骨脂和甘草配伍后,补骨脂酚药时曲线下面积(AUC)、最大血药浓度(C3.1.7补骨脂-甘草配伍对大鼠ast的影响单次经口给予补骨脂单煎液及补骨脂-甘草合煎液,补骨脂-甘草配伍组雄性大鼠的AST升高,但与溶剂对照组比较均无显著差异,见表2。马兜铃酸(0.07g·kg4讨论4.1大鼠的毒代动力学变化补骨脂酚是补骨脂的主要成分,研究证实CYP2C19,2C9和3A4等CYP酶亚型参与了补骨脂酚的肝代谢中药常为复方用药,补骨脂与甘草经常配伍应用。甘草次酸是甘草的主要活性代谢物,研究Zhuang等结合柱前衍生化与UHPLC-MS/MS方法对补骨脂酚大鼠体内的药代动力学进行研究,发现口服补骨脂酚的生物利用度仅为3.2%,可能与补骨脂酚在体内较低的吸收率或者大鼠体内的一相代谢过程有关本研究结果显示,大鼠单次灌胃补骨脂单煎液及补骨脂-甘草合煎液后,0.08h即可在血液中检测到补骨脂酚,证实补骨脂酚能迅速被大鼠的胃肠道吸收到达血液,但雌、雄大鼠毒代动力学参数明显不同,雌性大鼠代谢速率慢于雄性大鼠,此性别差异是否与补骨脂中补骨脂酚的雌激素样作用有关,还有待深入研究。比较分析大鼠灌胃补骨脂-甘草合煎液和等剂量补骨脂单煎液的代谢动力学参数,发现甘草成分对补骨脂酚的吸收、分布、消除均有一定程度影响。补骨脂-甘草配伍组大鼠血中补骨脂酚AUC,C4.2补骨脂对大鼠肝肾毒性的影响既往研究显示补骨脂酚对人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)具有明显的肾毒性血中尿素氮和肌酐是反映肾功能的指标,肾小球滤过受损较重时尿素氮和肌酐才明显升高本研究结果显示,补骨脂组、补骨脂-甘草配伍组NAG均显著升高,提示高剂量补骨脂可对大鼠肾小管产生一定的毒性,且补骨脂与甘草配伍组升高程度高于补骨脂组,但二者间无统计学差异;补骨脂组与配伍组KIM-1水平均升高,但与对照组相比未见显著差异。综上所述,补骨脂与甘草配伍使补骨脂酚在大鼠体内的