苹果栽培品种的荧光ssr分析

苹果栽培品种的荧光ssr分析

苹果是世界上最重要的果树之一。中国是世界上最大的苹果生产国，每年的苹果产量也超过了世界排名。苹果品质资源复杂多样，加之我国乃至世界各地的频繁交流，很容易造成苹果种质的混杂，为了对苹果种质资源进行保护，有必要对苹果品种资源进行准确鉴定，这也是对苹果种质资源保存和利用的前提，更是对其进行知识产权保护的必要手段。SSR标记是特异性强的一类分子标记技术，具有共显性、丰富的多态性、高度重复性及可靠性，同时操作简单等优点，近年来应用非常广泛本研究通过对选取的山定子和我国华北地区种植面积相对较大的25份苹果栽培品种作为试验材料，运用荧光SSR分子标记技术对供试材料进行分子鉴定，并在此基础上对供试材料进行了遗传多样性分析，同时建立了各供试材料的指纹图谱和分子身份证，并在分子水平对山定子作为最常用苹果砧木进行了验证，旨在为苹果种质资源的利用与知识产权保护提供理论基础。1材料和方法1.1家果皮种质兴城苹果家庭栽培品种为保证供试材料的可靠性，本研究选用的试验材料均取自国家果树种质兴城苹果圃，包括砧木系材料1份（山定子），栽培品种25份，其中，美国育成品种11份、日本育成品种7份、我国育成品种6份、加拿大育成品种1份（表1）。1.2测试方法1.2.1春季落叶松基因组dna的提取采用德国QI-AGEN的DNeasyPlantMiniKit的DNA试剂盒提取供试材料春季嫩叶基因组DNA。SSR引物序列选择扩增片段长度100～300bp，结合HOKANSON等1.2.2退火inPCR反应体系和PCR程序参照文献PCR程序：94℃预变性5min;94℃变性1min，退火1min（退火温度因引物而异），72℃延伸2min,32个循环；72℃延伸10min;4℃保存。PCR扩增采用乙醇进行纯化，95℃变性5min，在美国ABI3730基因测序仪上对纯化后的SSR荧光标记产物进行荧光检测，并对原始数据进行收集。1.2.3分子身份证构建在前期筛选出的16对荧光SSR引物中进一步筛选出7对SSR核心引物用于分子身份证构建。这7对SSR核心引物能对本研究选用的试验材料进行有效的区分，其分别是GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、H02d08、CH02d12。1.3ssr数据的计算及分析方法对ABI3730基因测序仪上获得的不同样品的指纹数据（即不同样品在每个SSR位点的扩增片段长度）利用GeneMapper3.0软件进行分析。遗传数据分析利用软件GenAlEx6.501进行，计算遗传多样性指标多态性等位基因数（Na）、SSR位点的有效等位基因数（Ne）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农多样性指数（I）以及固定指数（F）等。采用Jaccard相似系数，对供试材料的SSR数据应用NTSYS-pc2.10e软件进行计算，得到相似系数矩阵，然后利用UPGMA(UnweightedPair-GroupMethodwithArithmeticMean）方法进行聚类分析，从而构建出供试材料基因型间的亲缘关系树状图。利用PopGen32软件对获得的供试材料的指纹数据进行分析，得到各荧光SSR引物多态性，然后将每对引物获得的等位基因从小到大按照顺序进行排序，并对排列的等位基因用阿拉伯数字从0开始赋值，对供试材料在7个SSR位点获得的等位基因按照赋值数字分别进行编码，即可获得每份供试材料独有的字符串。在此基础上，将每份材料按照相同位点顺序排列的编码字符串利用条码技术转化成每份材料独特的条码标识，即得到不同材料的分子身份证。2结果与分析2.1荧光ssr位点监测和浓度系统16对荧光SSR位点的遗传多样性进行特征分析，结果如表3所示。对供试的26份材料基因组DNA在16对荧光SSR标记的位点进行PCR扩增，共得到139个多态性等位基因，其中，多态性等位基因数在5(NH015a）和11(CH05e03）之间，平均等位基因数（Na）为7.938，供试样品在每个荧光SSR位点产生2个相同（表现为单峰）或不同（表现为双峰）的等位基因数；有效等位基因数（Ne）在2.711(GD147）和6.563(GD142）之间，平均值为4.123；观察杂合度（Ho）在0.654和0.962之间，平均值为0.802；期望杂合度（He）在0.631和0.848之间，平均值为0.743；无偏杂合度期望值（uHe）在0.644和0.864之间，平均值为0.758；香浓多样性指数（I）在1.147和1.977之间，平均值为1.616；固定指数（F）平均值为-0.082（表3）。2.2ssr引物扩增带型检测利用筛选出的16对SSR荧光引物对26份供试材料进行扩增，准确获得了不同材料在不同位点的等位基因片段大小以及相应的毛细管电泳图，即指纹图谱（图1）。每对SSR引物的扩增带型为5～11个，平均为7.938个。26份苹果种质在16对荧光SSR位点的指纹图谱互不相同（表4），是各种质的特定谱带，获得的指纹图谱可以为种质鉴定提供理论依据。2.3供试材料间的亲缘关系分析根据16对SSR荧光标记扩增26份苹果种质的标记信息计算不同种质间的相似系数，得到各材料的Jaccard系数矩阵，并在此基础上，利用UPG-MA对供试材料进行聚类分析，构建出供试材料基因型间的亲缘关系树状图（图2）。26份供试材料之间的Jaccard相似系数分布在0.617和1.000之间，平均值达到0.805（表5），说明各供试材料之间在分子水平上亲缘关系相对较近（图2）。以相似系数0.617为标准，可以明显分为2个类群，类群I为山定子组，只有一个种质———山定子；类群II为苹果组，包括除山定子以外的其他苹果栽培品种。以相似系数0.680为标准，苹果栽培品种分为5类。2.4荧光ssr扩增对26份供试材料在7对荧光SSR位点获得的指纹图谱数据从小到大按顺序进行排列，并从0开始用阿拉伯数字进行赋值，其结果列于表6。例如，荧光SSR引物CH01f02对供试材料进行PCR扩增共获得了10个等位基因片段，其中，最小的等位基因片段为162bp，最大的等位基因片段为206bp，对未获得等位基因的位点标记为-9；先将等位基因片段按照从小到大顺序排列，并从0开始赋值，即将最小等位基因片段162bp赋值为0，最大等位基因片段206bp赋值为10，这样即得到了每份材料在荧光SSR引物CH01f02独有的字符串。以金冠为例，在7个荧光SSR位点GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、CH02d08和CH02d12获得的等位基因分别为142、135、214/233、116/118、170/179、225/225、220/232bp，其对应的赋值分别为6、4、0/5、3/4、1/9、4/5和3/6，按照排列获得的字符串即为66440534134536。然后再将字符串利用条形码技术转化成独特的条形码标识即为分子身份证（表7）。3讨论3.1知识产权生长材料种质资源是亲代传递给子代基因的载体，是种质创新和培育作物新品种的原始材料。种质资源的研究对于种质资源的利用效率、作物育种和生产发展的水平具有一定的意义3.2荧光ssr位点基因数和无偏杂合度本研究利用16对荧光SSR引物在26份材料中共扩增出139个多态性等位基因，多态性等位基因数在5(NH015a）和11(CH05e03）之间，平均等位基因数（Na）为7.938；供试样品在每个荧光SSR位点产生2个相同（表现为单峰）或不同（表现为双峰）的等位基因数；有效等位基因数（Ne）在2.711(GD147）和6.563(GD142）之间，平均值为4.123；观察杂合度（Ho）在0.654和0.962之间，平均值为0.802；期望杂合度（He）为0.631～0.848，平均值为0.743；无偏杂合度期望值（uHe）在0.644和0.864之间，平均值为0.758。一般认为，没有经过高强度的人工选择，遗传多样性较高的种群杂合度高于0.53.3苹果栽培品种与品种间的亲缘关系从分子水平上来说，遗传相似系数越小，种质间的遗传分化越大，遗传多样性也越高。本研究中，26份供试材料之间的Jaccard相似系数分布在0.617和1.000之间，平均值达到了0.805。相似系数越大，表明所选品种间的遗传关系越近，遗传多态性偏低，遗传基础相对狭窄。以相似系数0.617为标准，可以明显分为2个类群，类群I为山定子组，只有一个种质（山定子）；类群II为苹果组，包括除山定子以外的其他25个苹果栽培品种。这一结果仅就山定子和其他苹果栽培品种来说，山定子和其他苹果组材料之间遗传相似系数相对较低，二者间亲缘关系相对较远，另一方面就遗传相似系数来说，数值越大表明亲缘关系越近。本研究结果在相似系数0.617处分为2个类群，也表明山定子和苹果组种质间的遗传分化不是太大。山定子为我国苹果生产中经常使用的野生苹果砧木，与苹果嫁接亲和性高，说明苹果栽培品种与山定子间嫁接亲和性的差异与遗传信息确实有关，从而可以在分子水平上解释为什么山定子被作为最为常用的苹果砧木的原因。以相似系数0.680为标准，苹果栽培品种分为5类，II-1组只包括舞美一个品种，其为芭蕾苹果的一种、苹果中的极矮化品种，是英国东茂林试验站从威赛克旭（McIntoshwijeik）自然实生苗中选育的柱型苹果，与其他普通型苹果之间亲缘关系相对较远；II-2组只有祝光，其是美国古老品种之一、实生选种，早熟；II-3组是蜜脆，其为美国品种，中熟，由Macoun×Honeygold杂交选育而来。这一结果进一步证明，舞美、祝光和蜜脆与其他苹果栽培品种之间遗传距离相对较远。II-4组包括其余的22个苹果品种，在II-4组中分为两大组，其中，II-4-1组中以相似系数0.797为标准，初秋、旭和王林聚在一起，初秋是从红玉和金冠的杂交种中选育而来的；旭原产于加拿大，实生选种；王林是从金冠实生苗中选育而来的。说明它们之间相对遗传距离较近。在相似系数0.781处，千秋、秋红嘎拉、宫藤富士、长富1号、北海道9号、寒富、国光聚在一组，其中，千秋由东光（金冠×印度）×富士（国光×元帅）杂交而来；秋红嘎拉是嘎拉（（元帅×桔苹）×金冠）的芽变；宫藤富士、长富1号、寒富都是富士（国光×元帅）芽变；北海道9号是从富士（国光×元帅）×津轻的杂交后代中选育而来的，在这一组中富士系都聚在了一起。以相似系数0.836为标准，红星、元帅、金矮生和青香蕉聚在一起，红星苹果为元帅的芽变品种；金矮生是金冠的短枝芽变；青香蕉由实生选育而来。上述品种中除旭和青香蕉之外都有元帅和金冠的血缘，亲缘关系相对较近，而旭和青香蕉都是古老品种，由实生选育而来，说明这2个早期的苹果实生品种的来源很相近。II-4-2组，在相似系数0.828处，津轻、金冠、丹霞、乔纳金和秦冠聚为一组，其中，津轻为金冠的自然杂交种；丹霞是由金冠实生苗选育而来，乔纳金是金帅（金冠）×红玉的杂交种；秦冠是从金冠×鸡冠的杂交种中选育而来，在这一组中，津轻、丹霞、乔纳金和秦冠都含有金冠的血缘，从遗传学角度来说更多地保留了金冠的遗传特性。在相似系数0.750处，红玉、锦玉和中秋聚在一起，红玉为可口香的实生后代，原产于美国；锦玉是红玉的芽变；中秋是红玉和元帅的杂交种，中秋更多保留了红玉的遗传特性；锦玉和中秋都含有红玉的血缘。因此，红玉、锦玉和中秋聚在了一起。从聚类图中还可以看出，以相似系数1.000为标准，金冠和丹霞聚在了一起，丹霞是从金冠实生苗选育而来的。这一结果也显示，二者之间的亲缘关系很近，基本不存在差异。如果想对这些材料进行区分只能增加引物数量，以进一步筛选二者间多态性的引物，寻找之间的差异。本研究所用试材的