一点低温保存植物技术

了解植物种质离体保存的类型与特点；掌握离体保存方法的原理与程序。第一节第一节种质资源保存类型一、概念种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。种质库：是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，它有许多个体的不同基因所组成。又称基因库。种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统称为种质资源或遗传资源。二、种质保存的意义随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良乃至农业可持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再来。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。三、种质保存的方法按保存的地理位置分为原地保存和异地保存。原地保存是在原来的生态环境条件下,就地保存自,我繁殖品种资源,一般野生品种资源采用这种方式保存,如建立自然保护区,天然公园等；异地保存是将种子或植株保存于该品种资源原产地以外的地区,这种保存可采用植物园、种质园、种质库等形式或采用试管保存形式。按照保存的具体方法,品种资源的保存可分为种植保存、贮藏保存、试管保存、基因文库保存。1、 种植保存为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活力,并不断补充其数量,品种资源材抖须每隔一定时间播种一次,即种植保存。在种植保存时,种植条件尽可能与原产地相似,以减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选择的影响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然杂交和人为混杂。播种和收获时取样要有代表性以免因抽样而造成遗传漂移。总之要尽可能地保持原品种或类型的遗传特点和群体结构。此外,对来自自然条件悬殊地区的品种资源,可分别在不同生态地点异地种植保存。2、 贮藏保存贮藏保存就是用控制贮藏条件（主要是温度和湿度）的方法,来保持品种资源种子的生活力。长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和干燥,通过控制种子周围环境中的温湿度,迫使种子处于代谢作用的最低限度。贮藏保存种质资源采用种质库,种质库分三种：长期库、中期库和短期库。3、基因文库保存利用 重组技术，将种质材料的总 或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个 片断的克隆系。第二节 试管保存一、 常温下试管保存可利用试管苗继代培养保存，但需要经常更换培养基。二、 常温抑制生长保存为了延缓继代时间，可在培养基中添加长抑制剂或提高渗透压等。如脱落酸、矮壮素（2氯乙基三甲基氯化按，简称）、二甲氨基琥珀酸酰胺（简称）、多效唑（ ）等都是生长抑制物质，培养基中添加一定量可以延缓生长。9333一般情况下几个月继代一次，而添加这些物质后，可达到一年甚至以上。个人收集整理提高培养基渗透压也可以延缓生长。可用蔗糖或甘露醇，浓度分别调到10左右和4%—6%。三、 中低温调控生长保存在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。一般植物可调到1—9°C,热带、亚热带植物调至10—20°C。个人收集整理勿做商业用途四、 常温抑制生长保存与中低温调控生长保存相结合培养基中添加生长抑制剂或提高渗透压，培养温度降低，使继代时间延长。第三节 超低温保存一、超低温保存的基本原理和主要环节在液氮中（196C）,几乎所有的细胞代谢活动停止，仅保存细胞的活力和形态发生的潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。个人收集整理勿做商业用途超低温保存比较复杂，哪一步操作不当，都会使细胞受伤害，失去再生能力。注：超低温通常指低于一80C的低温，保存介质或容器有干冰一79C）、超低温冰箱8050°C）、液氮196C）和液氮蒸气相-0C）等，其中液氮最常用。二、超低温保存技术1、 保存材料的选择花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。2、 冷冻前材料预处理为了使保存材料适应超低温条件，必须进行预处理。预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（ ）、脯氨酸，在接近零度下培养数日。3、添加冷冻防护剂为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂。常用的冷冻防护剂有：二甲基亚砜( )、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、二甘醇、乙酰胺、福美氧化硫等。个人收集整理勿做商业4、 材料冷冻的方法材料冷冻保存的原理：冷冻时，细胞外的溶液水分子，先形成冰晶中心，而冰晶形成的速度与溶液成分、降温速度有关。一般在20°C—60°C范围内，晶体中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到140C时完全停止增长。个人收集整理|勿做5、 冷冻处理快速冷冻将植物材料从0°C或者其它预处理温度直接投入液氮中保存的方法。降温速度为1000°C/min。植物体内的水分在降温冷冻过程中，从10C—140C范围冰晶形成和增长的危险温度区，到140C时完全停止增长，关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，不能形成致死的冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。慢速冷冻法将植物材料从0°C或者其它预处理温度以降温速度为1~2C/min从起始温度降到100C，稳定1后投入液氮中保存或以此降温速度降至196°C。在这种降温速度下，细胞内水分有充分的时间不断渗入到细胞外结冰，使细胞内水分减少到最底限度，避免细胞内结冰个人收集整理勿做商业用途预冷冻法投入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法两步冷冻：慢速冷冻至40°C,停留一段时间，快速冷冻。逐级冷冻：材料通过不同温度等级降温至40°C,停留一段时间，投入液氮快速冷冻。干燥冷冻将材料置于27~29C烘箱内降低植物含水量，在投入液氮中保存。此法可以防止材料冻死。6、 材料保存196C液氮冰箱中或液氮罐中保存。7、 保存材料解冻解冻速度是解冻技术关键，一般在37C的热水浴中解冻。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。(1)快速解冻法保存材料直接投入到37~40°C水浴中进行解冻的方法。 0~0°C是再结冰的温度区（2）慢速解冻先置于0C解冻，在