湿地松胚性愈伤组织增殖的影响因素分析

湿地松胚性愈伤组织增殖的影响因素分析

湿地松是柏树科的一种速生树种，属于裸露的松科（pinaceae），在20世纪30年代引入中国。培养基的pH会影响培养基中外源激素和营养元素的作用效果，可能对培养物的生长状况产生不同的影响本研究以湿地松优良无性系的胚性愈伤组织为研究材料，探究了不同pH、碳源和谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响，期望能够获得适合湿地松胚性愈伤组织增殖的主碳源种类及使用浓度，明确最优pH范围，并回答谷氨酰胺能否被丙谷二肽替代的问题，以进一步降低培养成本，促进胚性愈伤组织迅速增殖并减轻褐化，为进一步提高湿地松胚性愈伤组织增殖的质量和数量奠定研究基础。1材料和方法1.1合代新品系的诱导获得胚性愈伤组织2019年6～7月从广东台山红岭种子园的湿地松精选种子园（混合代）中，采收优良单株自由授粉的未成熟球果，诱导获得胚性愈伤组织。单种子来源的胚性愈伤组织独立建立胚性无性系，从中选择已继代6次，增殖能力强，活力好的无性系PEE3-13进行本实验。1.2测试方法1.2.1组织特征观察从诱导的愈伤组织中选取直径2～5mm大小的愈伤组织材料置于载玻片上，用2%醋酸洋红和0.5%伊文思蓝先后对其进行染色，在体视显微镜下观察被染色的细胞团特征。鉴定出的胚性愈伤组织用于增殖培养。1.2.2细胞团继代培养将愈伤组织置于Y0固体培养基表面进行继代增殖，暗培养，23±1℃，每隔14d继代1次，继代时优选愈伤块表面新生的细胞团进行继代，以维持无性系的活力。Y0培养基以mP6为基本培养基1.2.3生物重复性试验在Y0固体培养基成分不变的情况下，高压灭菌前用1mol·L将PEE3-13的新生胚性愈伤称量每个平板约0.7g，轻轻置于培养基表面，并均匀分成7块，每块约0.1g，记录每个平板的初始接入质量，每个所设定pH条件下均接入10板作为10个生物学重复。将平板置于23±1℃，黑暗条件下进行培养，培养14d后，准确称重此时平板上的胚性愈伤总质量并记录。1.2.4红块糖对胚性愈伤组织增殖的影响以生工生物公司购买的蔗糖、麦芽糖及市场购买的精制白砂糖、红块糖为所测试的碳源种类，设置6个处理：30g·LPEE3-13的胚性愈伤组织的继代和称重方法同“1.2.2胚性愈伤组织增殖的最适pH筛选”，培养条件一致。1.2.5丙-谷二肽对胚性愈伤组织增殖的影响以Sigma公司购买的L-谷氨酰胺和广州乐试生物科技有限公司购买的L-丙-谷二肽为所测试的有机氮源，设置4个处理：(1)不添加任何谷氨酰胺或丙谷二肽，(2)450mg·LPEE3-13的胚性愈伤组织的继代和称重方法同“1.2.2胚性愈伤组织增殖的最适pH筛选”，培养条件一致。1.3数据统计分析增殖率（%）=（每板培养14d后的质量-每板初始接入的质量）/每板初始接入的质量×100%(1)数据统计分析采用SPSSStasitics21.0软件进行，使用Turkey法进行多重比较并用标记字母法表示差异显著性（不同小写字母代表在P<0.05水平差异显著）。2结果与分析2.1胚头和胚柄的结构利用湿地松未成熟球果诱导获得的愈伤组织有两种类型：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。胚性愈伤组织染色后在体视镜下可见分生组织细胞团组成的胚头（EC,embryonalmasscells）和胚柄（SC,suspensorcells）结构对所获得的无性系PEE3-13的愈伤组织进行染色鉴定，体视显微镜观察发现其具有胚头及胚柄结构，胚头细胞团密集，胚柄细胞呈长条形，紧随在胚头细胞团后（见图1）。因此，所鉴定的愈伤组织由胚性细胞组成，为胚性愈伤组织。2.2不同ph对湿地松培养基的影响对增殖培养基灭菌前和灭菌后的pH分别进行了测定，结果表明，灭菌前培养基调整至某一确定的pH后，在灭菌后仍会发生较大变化。当灭菌前的pH小于6.0时，灭菌后的pH升高，灭菌前pH越低，升高越多；当灭菌前的pH大于或等于6.0时，灭菌后的pH降低，灭菌前pH越高，降低越多（见表1）。因此，灭菌前调整培养基的pH至固定值并不能代表培养时该培养基的实际pH。在不同pH条件下，胚性愈伤的培养后质量和增殖率有很大差别（见表1）。当灭菌前pH调整为6.0，灭菌后pH变为5.68时，胚性愈伤的培养后质量和平均增殖率最高，平均增殖率可达到436.20%，但与灭菌前调整pH为7.0时没有显著差异，说明培养基实际pH范围为5.68～6.28时，均适宜胚性愈伤组织的生长。当灭菌前pH调整为4.0，灭菌后pH变为4.77时，胚性愈伤的培养后质量和平均增殖率最低，此时培养基凝固困难，呈凝胶流动状。当灭菌后pH未落在最适范围内时，平均增殖率均有所下降，说明胚性愈伤组织在增殖过程中对pH仍较为敏感。综上，在培养基灭菌前将pH调节至6.0～7.0左右，能够保证灭菌后pH在最适范围内，最大限度降低pH对胚性愈伤组织增殖的影响。2.3不同碳源对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响利用市售的精制白砂糖、红块糖与试剂公司购买的蔗糖和麦芽糖进行胚性愈伤组织增殖的比较研究，结果表明，不同碳源对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响非常显著（见表2）。增殖培养后质量及增殖率均在使用30g·L因此，市售精制白砂糖相比于纯蔗糖，更适宜湿地松胚性愈伤组织的增殖，但具体是其中的何种成分促进了增殖，还需进一步探索；而麦芽糖极不适宜湿地松胚性愈伤组织的增殖，即使浓度提高至45g·L2.4谷氨酰胺替代谷氨酰胺通过添加谷氨酰胺以及不同浓度的丙谷二肽，观察丙谷二肽能否替代谷氨酰胺用于胚性愈伤组织的增殖培养，结果表明，丙谷二肽添加后，即使增加使用浓度，培养后质量及增殖率均显著低于添加谷氨酰胺的处理组（见表3），说明丙谷二肽无法在湿地松胚性愈伤组织的增殖培养中替代谷氨酰胺。未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的处理组与添加谷氨酰胺的处理组相比，培养后质量及增殖率差异虽然略低，但差异不显著（见表3）；进一步在继代后观察到未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的处理组的胚性愈伤组织更容易褐化，多次继代后容易出现增殖困难和死亡，说明谷氨酰胺的缺乏即使在培养当代未显著影响增殖率，仍会潜移默化地影响胚性愈伤组织的细胞活力，使细胞活力降低。3体胚增殖过程胚性愈伤组织的增殖是松树体细胞胚胎发生的一个重要环节，胚性愈伤组织可在适当的培养基上长期继代培养，并具有发育为体细胞胚胎，萌发形成体胚幼苗的能力。影响针叶树胚性愈伤组织的增殖的因素有很多，其中包括碳源成分及浓度、微量元素、激素和琼脂的浓度、pH等，并且这些因素一直是体胚细胞胚胎发生过程研究的重点。2003年，曹新祥等人综述了植物组织培养中pH变化的有关问题：培养基的pH能够影响细胞的分裂和细胞增殖，当环境pH高于8时可启动细胞的分裂，偏低则抑制细胞分裂；pH还可影响植物材料的呼吸代谢状况、激素进出胞内和作用胚性愈伤组织在增殖时期，基本上不进行光合作用，需要额外添加碳水化合物作为能量。培养基中的碳源通常是由糖类提供。蔗糖是松属胚性愈伤组织增殖过程中最常用的碳源之一，常规使用浓度在10～30g·L氮元素对于植物的生长发育是至关重要的，在针叶树的体胚生长发育过程中，所需的氮全部依赖培养基供给，且有研究