地木耳乙醇提取物对大肠杆菌抑菌机理及化妆品的影响

地木耳乙醇提取物对大肠杆菌抑菌机理及化妆品的影响

又名地衣、地衣、地衣、地衣等。它是绿藻科的一种植物。这是一个观珠藻的集体。海藻丝由50.170个营养成分组成。1材料和方法1.1枯草芽孢杆菌、金孢杆菌、红藻杆菌、红藻杆菌地木耳购于市场。试验菌种有大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussabtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、白色念珠菌（Moniliaalbican）。1.2酵母提取物的制备LB培养基（固体培养基加琼脂粉15～20g）：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、水1000mL、自然pH,121℃高压蒸汽灭菌30min，备用。1.3方法1.3.1提取溶液，提取溶液将新鲜的地木耳洗净，干燥粉碎；料液比1∶50用95%乙醇溶液在40℃条件下提取10h，抽滤，收集滤液。旋转蒸发浓缩至2g/mL左右，用弱碱性树脂DEAE纤维素脱色，置于-4℃冰箱中保存备用1.3.2选择最佳试验菌将保存良好的菌种活化3次，采用抑菌圈法1.3.3最低抑制浓度测定用LB液体培养基将得到的地木耳乙醇提取物稀释2、4、8、16、32、64倍，分别向其中等量接种0.1mLE.coli菌悬液，置于摇床中，37℃、170r/min培养过夜，各浓度分别做3组平行，培养后观察并判定是否长菌（其中浑浊表示显著长菌，澄清表示未长菌），确定最低抑制浓度（Minimalinhibitoryconcentration,MIC)1.3.4平板中央浓度的测定取50μLE.coli菌悬液涂布于LB固体平板中央。待LB固体平板将菌悬液吸收完全后，在平板中央分别贴上在稀释倍数为2、4、8、16、32倍的地木耳乙醇提取物中浸泡1min的灭菌滤纸片，对照组贴无菌水浸泡1min后的滤纸片。将平板于37℃恒温培养箱中培养过夜，每个浓度梯度做3个平行。测量抑菌圈大小，确定地木耳乙醇提取物对E.coli的抑菌能力1.3.5地木耳乙醇提取物对a接种大肠杆菌到LB液体培养基中，置于摇床在37℃、170r/min条件下培养，接种2h后向试验组加入地木耳乙醇提取物（浓度由“1.3.3”的结果确定），对照组加等量无菌水，同时加入等量等浓度地木耳乙醇提取物于空白培养基以消除地木耳乙醇提取物对A1.3.7上清溶液中的总糖含量试验组和对照组操作同“1.3.5”。每隔一段时间取菌悬液离心，采用苯酚-硫酸法1.3.8上清液总蛋白质的测定试验组和对照组操作同“1.3.5”。每隔一段时间取菌悬液离心，采用考马斯亮蓝G-250法1.3.9地木耳护肤霜的制备1）地木耳保湿精华水的制备。原料组分按重量份数计为地木耳乙醇提取物4.0～8.0，甘油9.0～12.0，十六醇6.5～9.0，白油0.5～1.0，三乙醇胺0.5～0.8，羊毛脂0.1～0.2，尼泊金丙酯0.1～0.15，去离子水90～100，香精0.1～0.3。将甘油和去离子水恒温水浴加热至85℃左右，再向其中加入十六醇、白油、三乙醇胺和羊毛脂，加热并搅拌至完全熔化。过滤并灭菌。溶液降至65℃左右时加入地木耳乙醇提取物和香精。温度降至45℃时加入尼泊金丙酯，搅拌均匀后静置，即得所需化妆品。2）地木耳护肤霜的制备。原料组分按重量份数计为地木耳乙醇提取物4.0～8.0，去离子水70～80，甘油6.5～10，十六醇5.0～7.5，白油3.0～4.0，硬脂酸4.5～6.5，羊毛脂1.0～2.0，三乙醇胺0.3～0.6，香精0.1～0.3，尼泊金丙酯0.1～0.15。将硬脂酸、白油、羊毛脂、三乙醇胺和十六醇置于烧杯中，80～90℃水浴加热并搅拌至完全熔化，然后加入去离子水和甘油，充分搅拌后于45℃左右保温20min。过滤并灭菌。于温度降至65℃左右时加入地木耳乙醇提取物和香精。温度降至45℃左右时再加入尼泊金丙酯，搅拌均匀后静置，即得到所需化妆品。3）地木耳湿纸巾型面膜的制备。原料组分按重量份数计为地木耳乙醇提取物8.0～10.0，甘油6.0～7.0，十六醇5.5～7.0，羊毛脂2.5～3.0，白油0.5～1.0，无水乙醇2.0～3.0，三乙醇胺0.5～0.6，去离子水100～110，尼泊金丙酯0.1～0.15，香精0.1～0.3。将羊毛脂、十六醇、白油三乙醇胺在80～90℃下加热搅拌至完全熔化，然后加入去离子水和甘油，45℃水浴保温20min。过滤并灭菌。于温度降至65℃左右时加入地木耳乙醇提取物和香精，继续搅拌并加入尼泊金丙酯和无水乙醇，静置，得到面膜液。将洁净无菌的市售面膜纸浸润于面膜液中，即得到所需化妆品1.3.1种化妆品的受试方法1）地木耳化妆品感官测试及pH测试。直接用目测法观察化妆品色泽、气味及膏体黏稠度、涂展性等性质；使用pH计测定pH。2）地木耳化妆品稳定性测试。各取2份5mL地木耳保湿精华水、5g地木耳滋润霜、5mL面膜液。耐热试验：将3种化妆品中的试验组样品置于40℃电热恒温培养箱内，保温24h后取出，恢复室温后与置于室温下24h的对照组样品进行比较，观察其是否有浮油、变色、变稀、分层及硬度变化等现象发生。耐寒试验：将3种化妆品中的试验组样品置于-20℃电冰箱内，保持24h后取出，待样品恢复室温后与置于室温下24h的对照组样品进行比较，观察其是否有浮油、变色、变稀、分层及硬度变化等现象发生。冷热交替循环试验：将3种化妆品中的试验组样品置于40℃电热恒温培养箱内24h，取出在室温下放置24h，再置于-20℃冰箱中冷冻24h。此步骤循环3次，最后与另1份置于室温下的对照组样品进行比较，观察其是否有浮油、变色、变稀、分层及硬度变化等现象发生。离心试验：将3种化妆品中的试验组样品置于离心机中，2000～4000r/min离心30min后，取出与另1份置于室温下的对照组样品进行比较，观察其是否有浮油、变色、变稀、分层等现象发生3）地木耳化妆品安全性测试——斑贴试验。选择18～60岁符合试验要求的健康志愿者30名作为受试对象。选用市售合格斑试材料，将受试化妆品样品放入斑试器内，固体用量为0.03g，液体用量为0.03mL。空白对照孔不添加任何物质。将斑试器（加有受试化妆品样品）贴敷于受试者受试区域（前臂曲侧或背部）保持24h。除去斑试器后，分别间隔30min、24h、48h观察受试者皮肤反应4）美白功效测试——酪氨酸酶抑制测试。黑色素合成途径中的重要限速酶是酪氨酸酶，该酶通过影响酪氨酸转化为多巴，多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成5）保湿功效测试。健康的皮肤角质层应水分充足，皮肤水分充足可以增强皮肤弹性，减少皱纹生成和色素沉着。选好受试部位（所有志愿者受试部位相同）并做好标记。直接使用皮肤含水量测定仪测量标记区域的含水量，记录数据。前3块区域分别涂抹保湿水、护肤霜、面膜液[（2.0±0.1)mg/cm2结果与分析2.1最低抑制浓度的确定由表1可知，当稀释倍数在8倍及以下时，均未长菌，说明稀释8倍及以下时均有明显的抑菌作用。故可确定地木耳乙醇提取物对E.coli的最低抑制浓度（MIC）为8倍，即药物浓度为0.25g/mL。此结果为后续测定培养液电导率、总糖、可溶性蛋白质提供了试验基础。2.2抑菌圈试验测定地由表2可知，当地木耳乙醇提取物稀释8倍及以内时均出现了明显的抑菌圈，且在稀释倍数为2、4、8倍时，抑菌圈直径呈直线下降，说明滤纸片中的抑菌物质与稀释浓度呈正相关。当稀释倍数为16倍时，有2组试验中未出现抑菌圈，表明在该稀释倍数下滤纸片中的抑菌物质的含量不足以抑制E.coli的生长和繁殖。此结果可与最低抑制浓度（MIC）的测定试验相互印证。2.3地木耳乙醇提取物对e.coli表达的抑菌机理E.coli在接种2h后开始进入对数生长期，对数生长期的E.coli菌体活性较高。较高的代谢水平有利于抑菌物质及时作用于菌体，故选定在接种2h后向LB液体培养基中加入地木耳乙醇提取物，以测试各项指标，研究地木耳乙醇提取物对E.coli的抑菌机理。由图1可知，当向菌悬液中加入地木耳乙醇提取物后（2h），试验组E.coli繁殖基本停止，地木耳乙醇提取物加入2h内有部分菌体死亡导致菌悬液浓度降低，即地木耳乙醇提取物可影响E.coli的正常生长。同时对照组E.coli生长状态良好，繁殖速度快，进一步证明试验组E.coli的生长停滞是由此试验的惟一变量因素导致的。2.4地木耳乙醇提取物对e.coli液体培养基上清液电导率的影响细胞膜能维持细胞内环境稳定。当细胞膜被破坏时，细胞质中大量电解质将进入到液体培养基中，导致培养基的电导率上升。此时，可通过测定培养物上清液电导率来反映细菌细胞膜渗透性的变化情况由图2可知，当向菌悬液中加入地木耳乙醇提取物后，LB液体培养基上清液电导率开始升高，且随着地木耳乙醇提取物对E.coli作用时间的延长而持续升高，这说明加入地木耳乙醇提取物后E.coli细胞膜被破坏而发生胞质渗漏，且发生胞质渗漏的速度不断加快。加入地木耳乙醇提取物4h后，试验组上清液的电导率达到最大值，说明此时已经导致大部分菌体细胞破损，地木耳乙醇提取物能在短时间内破坏E.coli细胞壁，达到抑菌的目的。2.5地木耳乙醇提取物对e.coli液体培养基上清液可溶性总糖含量的影响E.coli会储备糖类作为能源储备物质，当其膜结构完整性遭到破坏时，细胞内的物质（如糖类等）会进入培养基中，导致培养基中可溶性总糖浓度上升。可通过观测培养物上清液中可溶性总糖浓度的变化，间接反映细菌膜结构的完整性由图3可知，在加入地木耳乙醇提取物之后，E.coli培养物上清液中的可溶性总糖浓度开始升高，说明加入地木耳乙醇提取物后部分细胞开始渗漏出糖类进入培养基。在加入地木耳乙醇提取物4h左右，E.coli培养物上清液中可溶性总糖浓度达到最大值，说明此时大部分E.coli细胞膜遭到破坏，菌体内容物逐渐渗漏到胞外。同时对照组培养物中可溶性总糖浓度因E.coli的正常生长繁殖消耗而逐渐降低。此结果与上述试验中电导率的结果一致。2.6地木耳乙醇提取物对coli培养物上清液蛋白质含量的影响由图4可知，在加入地木耳乙醇提取物后，E.coli培养物上清液中的可溶性蛋白质含量开始显著升高，说明加入地木耳乙醇提取物导致部分细胞的细胞膜遭到破坏从而使蛋白质流出2.7地耳膏的性质测试2.7.1感官和ph的测量通过对地木耳化妆品的感官测试和pH测定，发现制备的化妆品均符合国家化妆品标准，具体结果见表3。2.7.2稳定性试验的结果通过稳定性测试，发现制备的化妆品的稳定性均表现良好，在改变温度以及离心的条件下，其性能均可保持稳定（表4）。2.7.3地木耳化妆品的注意事项斑贴试验结果表明，未出现红斑、水肿、丘疹、水疱等不良反应，也未出现过敏反应。在使用地木耳化妆品时，觉得涂抹部位滋润清凉舒适。由此可以初步判断地木耳化妆品对人体皮肤没有危害，无毒副作用。2.7.4氨酸酶的抑制作用1）美白功效。从测试结果来看，地木耳化妆品对酪氨酸酶活性均有一定抑制作用，其中地木耳湿纸巾型面膜对酪氨酸酶的抑制作用最好（图5）。若长期使用此类护肤品可以达到一定的美白效果。2）保湿功效。由表5可知，每个地木耳化妆品涂敷的部分含水量远高于空白对照部分，说明地木耳化妆品能有效补充皮肤流失的水分，保持肌肤弹性。涂敷1h后，试验组皮肤含水量仍高于空白对照组，可使皮肤长期处于水分充足的状态，预防皮肤皲裂。3地木耳化妆品功效成分地木耳乙醇提取物有良好的抑菌性，对E.coli的最低抑制浓度（MIC）为0.25g/mL。E.coli在经过地木耳乙醇提取物处理后会发生胞质渗漏，发挥作用速度较快，且随着作用时间的延长胞质渗漏现象越来越明显，在加入地木耳乙醇提取物4h后大部分菌体细胞膜破损，能在短时间内达到抑菌的目的。所制备的地木耳化妆品的感官评价和pH均符合国家化妆品标准，并在改变温度和离心的情况下均表现出了良好的稳定