苯磺酸氨氯地平对夹杂带丝猪抗氧化酶活性的影响

苯磺酸氨氯地平对夹杂带丝猪抗氧化酶活性的影响

0底栖无脊腰椎生物的分布作为一种广泛使用和潜在健康效应的新兴污染物，药物和个人护理产品（pps）已引起人们的关注。夹杂带丝蚓(Lumbriculusvariegatus),带丝蚓目,带丝蚓科(Lumbsriculidae),是一类底栖无脊椎生物,一般栖息在河流,湖泊,池塘,沼泽地、水库沉积物上层好氧区,是水生食物链中的重要组成部分,在我国主要分部于广东、黑龙江、湖南、江苏、江西、新疆、西藏等地,繁殖周期约为2~3周。根据美国EPA600/R-99/064(Methodsformeasuringthetoxicityandbioaccumulationofsediment-associatedcontaminantswithfreshwaterinvertebrates)本文以夹杂带丝蚓为实验模式生物,研究AB对夹杂带丝蚓的急性毒性及长期暴露的毒性效应,考查AB对夹杂带丝蚓体内超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的影响,筛选灵敏的生化指标作为AB类PPCPs对水体污染的早期预警指标,以期为PPCPs的生态风险评估提供必要的生态毒理学基础数据支持。1材料和方法1.1试验方法和设备AB(纯度98%,购自sigma-aldrich公司),以二甲亚砜(DMSO)作为助溶剂,助溶剂体积比控制为0.1%(预试验证实在此助溶剂浓度对毒性试验结果没有影响)。试验中用于稀释溶液的水均为曝气24h以上的自来水。供试夹杂带丝蚓自2015年从西藏林芝市野外采集,中南民族大学实验室人工驯养繁殖,养殖温度控制在20±2℃,控制光照周期:16(光照):8(黑暗),每天喂食少量粉末饲料。带丝蚓养殖所用溶液用超纯水根据如下比例配制:NaHCO1.2实验方法1.2.1ab试验质量浓度采用半静态法进行急性毒性试验,AB暴露液的更换频率为24h。首先进行预试验,确定夹杂带丝蚓全部致死的最低浓度和无毒性效应的最高浓度,再设置AB试验质量浓度为0.500,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00,12.00mg/L8个浓度,同时设空白对照和助溶剂对照,每组3个平行。于250mL的烧杯中加入100mL的暴露液,各组放入经驯养后个体大小一致的夹杂带丝蚓40条,整个试验周期为96h,间隔12h观察夹杂带丝蚓的死亡状况并做好记录,同时处理死亡的夹杂带丝蚓,绘制出相关性曲线。1.2.2酶活性测定及动态试验静态试验:根据1.2.1急性毒性试验结果,设置0.025,0.100,0.500和1.00mg/L4组安全浓度进行长时间暴露试验。在500mL烧杯内放入个体大小一致的夹杂带丝蚓80条,同时设置对照组,加入400mL试验浓度溶液,每隔24h更换1次,每组设3个平行。暴露1和7d后。取样测定夹杂带丝蚓体内酶活性。动态试验:固定1.000mg/L质量浓度,同时对照组,经一定时间间隔取样测定夹杂带丝蚓体内酶活性,暴露时间最长为10d。每隔24h更换1次暴露溶液,每组设置3个平行。染毒结束后,从烧杯中取出夹杂带丝蚓个体,用滤纸吸干个体表面水分,称重后,按1∶10(质量/体积)加入磷酸盐缓冲液(pH值8.0,浓度0.1mol/L),进行冰浴匀浆。匀浆液经于4℃,8000r/min下离心15min。取上清液,低温保存待检测。1.2.3sod,cat和pod酶活性检测蛋白检测采用Bradford法蛋白检测试剂盒,购置南京建成生物工程研究所生产的检测试剂盒,SOD,CAT和POD酶活性均使用对应的检测试剂盒进行检测,按使用说明进行分析检测。1.3处理数据试验数据采用SPSS和EXCEL软件进行分析与处理,半致死剂量效应浓度(LC2结果与讨论2.1ab对产品的急性毒性试验进行过程中,空白对照的夹杂带丝蚓没有发生异常现象以及死亡,同样DMSO助溶剂对照组也未发生上述情况,这便说明了助溶剂DMSO不会对实验结果产生影响。AB对夹杂带丝蚓的急性毒性试验结果显示,随着暴露浓度的增加,夹杂带丝蚓死亡率呈逐渐上升的趋势。对96h浓度对数与概率单位的回归方程、LC2.2ab对残余带丝砂体sod活性的影响AB暴露对SOD活性的影响见图1。由图1可知,无论是暴露1d还是7d,随着暴露浓度的增大,SOD活性均表现为先升高后降低,呈倒U型变化。与对照组相比,0.025mg/L低质量浓度暴露即可对SOD产生极显著诱导(P<0.01),当AB暴露质量浓度为0.100mg/L时,SOD活性达到最大值,其活性分别为对照组的1.53和1.87倍。当AB暴露质量浓度大于0.100mg/L后,SOD活性出现下降,然而经过对比发现,各浓度组的SOD活性仍比对照组的活性高。SOD酶作为生物体内重要的活性氧自由基清除剂,在AB暴露浓度较低时,由于受到氧化胁迫,夹杂带丝蚓体内SOD酶被诱导而活性升高,而当AB浓度增大或暴露时间延长时,过量的AB氧化胁迫可迫使夹杂带丝蚓机体产生活性氧的量增大,SOD的活性随之被诱导并逐渐升高。但过高的浓度会导致体内活性氧自由基含量的增长要高于SOD酶的诱导能力,这种歧化能力超出正常水平现象的出现,会使得整个的细胞膜系统遭到破坏并且生理代谢功能发生紊乱,最终会抑制SOD的活性从而表现出下降的趋势2.3cat的活性AB暴露对CAT活性的影响见图2。由图2可知,暴露1d后,各浓度组CAT活性显著被诱导(P<0.05),与暴露1d相比,暴露7d后,CAT活性显著下降(P<0.05),呈现先诱导后抑制的效应。暴露1d后,CAT活性在质量浓度为0.025mg/L时就可被诱导,当AB质量浓度为0.100mg/L时达最大,为对照组的1.75倍。质量浓度>0.100mg/L时活性有所下降。文献报道,CAT作为双氧水浓度的调节器,在谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的协同作用下,可与POD酶一起通过将SOD酶歧化超氧阴离子自由基的双氧水产物转换为水和氧的方式来降低细胞内双氧水的浓度,进而将机体受到污染物的毒害减轻2.4ab暴露对pod活性的影响AB暴露对POD活性的影响见图3。由图3可知,无论是暴露1d还是7d,0.025mg/L低浓度质量组POD活性被最大诱导,与对照组相比差异极显著(P<0.01),暴露1d的数据是对照组的1.33倍,暴露7d的数据则是对照组的1.43倍。POD的活性在暴露浓度不断增大的情况下呈现出逐步下降的趋势,当AB暴露质量浓度增大至1.000mg/L时,POD活性降至最低,与对照组相比表现为显著抑制。该结果与陈雨萌等2.5ab暴露时间对cat活性的影响夹杂带丝蚓体内酶活性随暴露时间的变化见图4。由图4可知,开始暴露时夹杂带丝蚓体内SOD酶活性先快速升高,3d后达到最大值,增长率约为40%。随着AB暴露时间的延长,SOD酶活性逐步受到抑制,到第7天后接近空白对照的水平,随后基本不变。CAT酶活性也是随暴露时间的延长,开始快速上长升,到第5天时CAT活性达到最大,此时CAT活性大约为暴露前的1.77倍,随后开始快速下降,到第10天时,CAT活性约为暴露前的67%。POD的活性在AB暴露时间为1d时便明显降低,当暴露到第3天时它的活性又升高到最高,之后随着AB暴露时间的延长,POD活性再次受到抑制,到第10天时,与暴露前相比表现为极显著抑制(P<0.01),抑制率约为37%。由图1~图4可见,CAT活性随暴露浓度和暴露时间的变化与SOD和POD相比更大,相对来说更加灵敏。3氨氯地平对残余带丝砂抗氧化酶活性的影响近年来,有关PPCPs在水环境中的分布及对人类与动植物的健康风险的研究,越来越受到环境科技工作者的关注。但作为一类广泛应用的治疗高血压药物,氨氯地平在环境中的分布及对野生动物的毒性效应,还鲜有报道。ASHFAQ等(