核桃内生生防菌h-q6的研制

核桃内生生防菌h-q6的研制

近年来，随着对食品安全、污染控制和生态平衡等诸多问题的关注，减少了化肥和农药的使用，微生物酶和生态菌肥的开发和开发已成为植物和农药学术界的热点。生防菌剂的剂型较多的是可湿性粉剂、悬浮剂及颗粒剂,其中,乳悬剂为悬浮剂中的一种,是以溶剂油为主要成分,添加不同的助剂,如乳化剂、抗生素、防冻剂等,加工制成高效无公害、性质稳定、对人和环境安全的微生物农药制剂本试验以Ht-q6菌株为材料,以目前生产上危害严重的番茄早疫病菌为指示菌,通过助剂的筛选,按照国家质量标准,研制出生防菌Ht-q6乳悬剂,旨在为生产上开发应用提供资源。1材料和方法1.1试验材料供试菌株为生防菌Ht-q6和番茄早疫病菌(Alternariasolani),均由山西农业大学植物病理实验室提供。1.2药物、防冻剂和润湿剂溶剂油为芥末油、花椒油、芝麻油、花生油、胡麻油。乳化剂为吐温-80和OP-10。抗生素为两性霉素、灰黄霉素、制霉菌素。防冻剂为氯化钙、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。润湿剂为十二烷基苯磺酸钠,洗衣粉,D-317,DCM-82。稳定剂为CaCO1.3测试方法1.3.1活化菌株培养用接种环挑取生防菌Ht-q6,通过平板划线培养法,将其接种于NA平板上进行活化培养24h,然后将活化菌株接种到100mLNB培养液中,接种量1%,置于摇床上,以30℃,180r/min速度振荡培养72h,芽孢率≥90%。1.3.2分生孢子法培养取番茄早疫病菌接种在PDA平板上,将其置于26℃恒温培养箱中培养7d后,用无菌刀把培养物切成5mm×5mm的菌块,接入水琼脂培养液中,黑暗放置3d后产生大量分生孢子,用无菌水稀释振荡均匀,得到浓度为101.3.3生防菌ht-q6乳液1.3.3.芽孢存活率测定溶剂油:取1mL生防菌Ht-q6发酵液分别加入到10mL不同的溶剂油中,置于小锥形瓶内,密封后室温下贮存,并定期取0.1mL加入到10mL的NB培养液中,测定其芽孢存活率。乳化剂:将选出的最佳溶剂油取10mL置于小锥形瓶中,分别加入1mL的吐温-80,OP-10及吐温-80和OP-10(体积比为1∶1)的混合物,再向其中加入1mL的发酵液,振荡均匀后,测定芽孢存活率。每隔7d取0.1mL分别加入到10mL不同浓度的最佳乳化剂中,振荡均匀后测定芽孢存活率。以上各处理均在(25±1)℃下摇床振荡培养,每个处理重复3次,用平板菌落计数法测定并记录不同时间芽孢存活率,以芽孢存活率的高低判定溶剂油优劣以及测定不同乳化剂对芽孢活性的影响。1.3.3.润湿剂和稳定剂的筛选将4种润湿剂(10%)和4种稳定剂(2%)分别添加到已经筛选出的上述配方中,测定添加润湿剂和稳定剂后的悬浮率、润湿时间和芽孢存活率,每个处理3次重复,以不加润湿剂和稳定剂的配方为对照,筛选出最佳润湿剂和稳定剂。1.3.3.保护剂的筛选将4种保护剂按10%分别加到已制备的乳悬剂中,测定添加保护剂的悬浮率、润湿时间,以不加保护剂为对照,在254nm紫外灯下距离40cm处照射6,12,24h后计算芽孢存活率。1.3.4活菌数测定取2mL试样和18mL的无菌水置于100mL的锥形瓶内,振荡均匀。采用平板菌落计数法测定活菌数,每隔6d测1次,当活菌数出现大量减少时,改为每隔3d测一次,直到活菌数接近于零,记录测量间隔时间及活菌数。根据稀释倍数计算出1mL样品中的活菌数。1.3.5平板菌落计数法参考《中华人民共和国农业部标准》(GB4789.2—2010),采用平板菌落计数法,测定制剂的芽胞含量。即将乳悬剂按10倍梯度依次稀释7次后,取最后稀释液0.1mL均匀涂布于平板上,计算菌落数。根据公式计算菌株存活率(S其中,M为含生防菌的乳悬剂在NA平板上的菌落数(cfu/g);M1.3.6性能的测定按照《中华人民共和国国家标准》对生防菌Ht-q6乳悬剂的各项质量指标进行测定,如倾倒性、热贮稳定性、低温稳定性、杂菌率、pH和细度。倾倒性的测定按HG/T2467.5—2003方法。热稳定性的测定按GB/T19136—2003方法。低温稳定性的测定按GB/T19137—2003方法。悬浮率的测定按照GB/T14825—2006方法;pH值测定按照GB/T1601—1993方法。1.3.7生防菌ht-q6乳液的安全性评价1.3.7.接种法:变革培养,引进菌种,并将番茄苗打造成菌悬液的土壤排汗用接种针蘸取生防菌Ht-q6乳悬剂10倍稀释液直接穿刺接种番茄叶片和茎部,保湿培养,以穿刺接种无菌水作为对照。然后将番茄苗的根部洗净,浸根于菌悬液中接种,再将番茄苗移栽至含无菌土的育苗钵中,常规管理;以根部浸于无菌水为对照,每个处理5株番茄(5~6片叶),3次重复。1.3.7.生防菌ht-q6乳悬剂安全性测试依据国家安全标准GB/T15670.2—2017,以大鼠为材料,通过急性经口毒性、急性经皮毒性和急性皮肤刺激试验,测试生防菌Ht-q6乳悬剂对大鼠的安全性2结果与分析2.1最佳溶剂油的确定从表1可以看出,芥末油在21d后芽孢存活率为0,效果最差。花生油处理的芽孢存活率与其他处理相比,仅在7,14d时与芝麻油处理的差异不显著,其余时间段与其他处理间差异显著。故确定花生油为最佳溶剂油。从表2可看出,14d之前芽孢存活率在66%~100%,其中,OP-10对芽孢的存活率影响最低,与其他处理差异显著。14d之后吐温-80与OP-10混合乳化剂对芽孢存活率的影响减小,与其他处理相比差异显著,确定选择该混合物作为乳化剂。由图1可知,芽孢存活率随乳化剂添加比例的升高而降低,确定0.2%为混合乳化剂的最佳添加比例。2.2添加2种霉素由表3可知,随着3种抗生素质量浓度的增加,对番茄早疫病菌抑制作用逐渐增强。其中,加入15μg/mL的制霉菌素和两性霉素,对番茄早疫病菌抑制作用较好且与对照差异不显著,当质量浓度继续增加时,对乳液的抑菌效果有增效作用。考虑到价格和用量问题,最终确定15μg/mL的制霉菌素添加于生防菌Ht-q6乳悬剂中。2.3不同防冻剂对芽孢保水性的影响由图2可知,添加丙二醇和丙三醇的处理,芽孢存活率分别为12.2%和19.4%,与其他处理相比具有显著性差异;氯化钙、乙醇和乙二醇与对照相比,对芽孢存活率的影响较小。由此得出,氯化钙、乙醇和乙二醇适合作为防冻剂。从表4可以看出,当防冻剂浓度小于6%时,随防冻剂浓度的增加对芽孢的保护作用逐渐增强,当乙二醇浓度为6%时,芽孢存活率最高,达到85.4%,与其他处理差异显著,但与对照差异不显著。因此,确定6%的乙二醇作为乳悬剂的防冻剂。2.4润湿剂的筛选从表5可以看出,十二烷基苯磺酸钠的悬浮率为65.6%,与其他处理相比差异显著;润湿时间为28.5s与洗衣粉差异不显著并且芽孢存活率最高,为89.1%。在田间润湿时间越短越能发挥药效,最终确定十二烷基苯磺酸钠作为乳悬剂的润湿剂。从表6可以看出,KH2.5不同处理前后悬浮效果对比由表7可知,抗坏血酸的悬浮率为76.2%,润湿时间为(37.4±1.8)d,与其他处理间差异显著,悬浮效果与润湿性能最好;抑菌圈直径与对照组差异不显著且添加抗坏血酸后对芽孢活性影响小,确定最佳紫外保护剂为抗坏血酸。2.6沉淀、微分层制剂外观为可流动的乳白色黏稠液体;贮存过程中有少量沉淀或微分层,经摇动能恢复原状,无结块。由表8可知,出生防菌Ht-q6乳悬剂的芽孢含量为2.54×102.7活菌量的变化从图3可以看出,生防菌Ht-q6乳悬剂的活菌量在贮藏前54天时变化不明显,减少幅度较小,从54d开始活菌量变化幅度增大,当贮藏80d时含量接近于零,说明乳悬剂的有效贮藏时间为80d左右,而在54d之内使用效果最佳。2.8ht-q6支持生防菌ht-q62.8.1乳悬剂多次灌溉时番茄植株的发病情况结果表明,番茄叶片和茎秆用接种针穿刺接种培养3d后,与对照组没有明显差异,番茄植株经乳悬剂100倍稀释液多次浇灌后,无发病状况。确定生防菌Ht-q6乳悬剂对番茄植株没有致病性。2.8.2低毒乳悬剂溶液急性经口毒性和急性经皮毒性测试表明,该乳悬剂属于低毒性。在急性皮肤刺激试验周期内,试验鼠的皮肤涂抹部位未出现红斑、水肿,表明乳悬剂对皮肤没有刺激性。3乳悬剂的研发技术有待进一步提高本试验通过对溶剂油、乳化剂、防冻剂和抗生素等助剂的筛选,确定了生防菌Ht-q6乳悬剂的最佳配方。经检测,制剂的各项质量指标达到国家要求,毒性测试表明该乳悬剂属于低毒性,产品配方成本经济,加工工艺简单,质量稳定,为其他生防菌剂助剂的开发提供了参考。由于乳悬剂在农药制剂中发展历史较短,并处于不断完善中,故在产量上仍远远低于乳油和可湿性粉剂与发达国家相比,我国乳悬剂的研究技术仍然存在很多问题,农药生产企业的自主研发能力较弱,国内现行产品标准中许多技术指标与国外现行产品存在较大差距。如国内的悬浮率在85%以上,而国外一般达到95%以上。这直接影响了制剂的储存时间,同样也是阻碍此剂型推广应用的一大技术性难题1.3.3.番茄早病菌菌轴将已经筛选出的溶剂油和乳化剂的最佳配比与生防菌Ht-q6发酵液混合制成乳液,然后将不同抗生素按照质量浓度为5,15,25,50μg/mL加到乳液中。将番茄早疫病菌孢子悬浮液均匀涂布在PDA平板上,自然晾干后在平板中央打一直径为5mm的孔。用移液枪取5μL上述处理的乳液于孔中,每个处理3次重复,以不加抗生素的乳液作为对照。将所有平板置于(25±1)℃的恒温培养箱中培养4d后,测量抑菌圈直径。1.3.3.两组重复处理取1mL不同防冻剂分别加入到10mL生防菌Ht-q6发酵液中充分混合,稀释后取0.5mL均匀涂布于NA平板上,以不加防冻剂的发酵