地奥血瘀康胶囊的研制

地奥血瘀康胶囊的研制

地奥李家康是中国科学院成都生物研究所开发的一种预防和治疗心血管疾病的天然药物。其活性成分是黄山药根的提取物，后来通过龙甘薯粉添加药物。地奥心血康具有活血化瘀、行气止痛、扩张冠脉血管和改善心肌缺血等功效,可用于预防和治疗冠心病、心绞痛以及瘀血内阻之胸痹、眩晕、气短、心悸、胸闷等病症。地奥心血康的活性物质基础为甾体皂苷本次实验主要是通过地奥心血康的肠内菌离体代谢,用薄层色谱的分析方法并结合甾体类化合物的特定显色反应来快速简便的鉴定其代谢产物,目的是寻找和发现新的有活性的代谢产物。在发现该代谢产物有活性后,可以为新药开发提供线索,以新的活性成分为前体进行结构修饰筛选出高效药物,为寻找创新药物增加新的机会和途径。1实验材料和设备1.1胶囊、国药地奥心血康胶囊(成分:甾体总皂苷;性状:本品为硬胶囊,内容物为浅棕黄色的粉末,味微苦;国药准字Z10910051;产品批号0608027,代号451),成都地奥制药集团有限公司研制。1.2动物大鼠:雄性,体重162~198g,由药理教研室提供。1.3试剂和仪器甲醇(分析纯),天津市富宇精细化工有限公司;三氯甲烷(分析纯),天津市广成化学试剂有限公司;乙酸乙酯(分析纯)天津市富宇精细化工有限公司;石油醚(60~90℃)(分析纯),汕头市西陇化工厂;正丁醇(分析纯),广东光华化学厂有限公司;乙醇(分析纯),天津市富宇精细化工有限公司;盐酸(化学纯),汕头市光华化学厂;硫酸(分析纯),新光化工试剂厂;HG/T235492H薄层层析硅胶(化学纯):青岛海洋化工有限公司;无水碳酸钠(化学纯),汕头市西陇化工厂;磷酸氢二钾(分析纯),天津市福晨化学试剂厂;磷酸二氢钾(分析纯),汕头市光华化学厂;氯化钠(分析纯),天津市福晨化学试剂厂;硫酸铵(化学纯),汕头市光华化学厂;无水氯化钙(分析纯),天津市福晨化学试剂厂;硫酸镁(分析纯),天津市福晨化学试剂厂;对二甲氨基苯甲醛(分析纯),广州化学试剂厂;磷钼酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;L-抗坏血酸(分析纯),天津市天新精细化工开发中心;牛肉浸膏(生化试剂),北京双旋微生物培养基制品厂;蛋白胨(生化试剂),北京双旋微生物培养基制品厂;营养琼脂(生化试剂),广东环凯微生物科技有限公司;盐酸-L-半胱氨酸(生化试剂),上海润捷化学试剂有限公司;厌氧产气剂注:(1)厌氧产气剂与氧气接触就能生成CO1.4酶设计DT系列电子天平(规格Max=3000g,d=0.1g;量制苏字00000176号),中国江苏常熟长青仪器仪表厂;FA1004型电子天平(规格Max=100g,d=0.1mg;沪制00000191号),上海良平仪器仪表有限公司;马头牌JYT-2架盘药物天平(规格Max=200g,d=0.2g;沪制00000271号),上海光正医疗仪器有限公司;LD4-2A低速离心机(规格Max=5000r/min;京药管城(准)字2001第2410227号),北京医用离心机厂;GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;HSGⅡB-4电热恒温水浴锅,上海仪表(集团)供销公司;AG0252.5L厌氧培养罐(带12皿支架),广州雷得生物技术有限公司。2实验方法2.1氨基苯甲醛的制备1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂的制备:称取0.5g对二甲氨基苯甲醛,加入37.5mL甲醇溶解,再缓慢加入12.5mL盐酸,摇匀即可。5%磷钼酸乙醇试剂的制备:称取2.5g磷钼酸加入50mL乙醇溶解,摇匀即可。2.2cmc-na溶液称取5gCMC-Na(羧甲基纤维素钠)加入1000mL蒸馏水加热溶解,冷却后得5‰CMC-Na溶液。取适量硅胶H加入适量用棉花过滤得到的5‰CMC-Na溶液,研磨成没有气泡并具一定稠度的糊状物,然后用手动铺板器铺成0.5mm厚的硅胶H薄层板,晾干,放入烘箱中在105~110℃温度下烘0.5~1h,取出即可。2.3稀盐酸溶液的配制称取3.9gK称取2.35gKH称取8gNa称取2.5gL-抗坏血酸溶于10mL蒸馏水中得到25%L-抗坏血酸溶液。量取1mL浓盐酸加入20mL蒸馏水得到稀盐酸。量取37.5mL溶液A、37.5mL溶液B、50mL溶液C、2mL25%L-抗坏血酸溶液、0.5g盐酸-L-半胱氨酸、1g牛肉浸膏、1g蛋白胨、1g营养琼脂,加蒸馏水至1L,最后用稀盐酸调pH值至7.5~8.0就得到厌氧培养液。2.4正丁醇的制备取正丁醇适量(约20mL)加入蒸馏水稍过量(约15mL)混合,振摇,静置,取上层液体即得。2.5地奥空心康胶囊制备取健康大鼠新鲜粪便,称量得33.3g,按照1g∶5mL的比例将粪便与166.5mL厌氧培养液混合,搅拌制成悬浊液,用医用纱布过滤得到126.0mL肠菌培养液,加入0.1522g地奥心血康胶囊内容物使其溶解,然后将含药物的肠菌培养液平均分成两份,每份63.0mL。其中一份置于2.5L厌氧培养罐中,同时放入厌氧指示剂,用厌氧产气剂耗去罐内的氧气(该厌氧产气剂与氧气接触就生成二氧化碳和水)使罐内形成厌氧环境用于肠道厌氧菌培养,并把该厌氧培养罐置于37℃电热恒温鼓风干燥箱中培养24h,培养混合物用21mL水饱和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度为1500r/min离心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,为代谢24h的样品溶液。另外一份马上用21mL水饱和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度为1500r/min离心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,为代谢0h的样品溶液。在地奥心血康用大鼠肠内菌代谢24h完成后,再取大鼠新鲜粪便,称量得17.0g,按照1g∶5mL的比例将粪便与85.0mL厌氧培养液混合,搅拌制成悬浊液,用医用纱布过滤后取63.0mL肠菌培养液,加入0.0763g地奥心血康胶囊内容物使其溶解,置于2.5L厌氧培养罐中,同时放入厌氧指示剂,用厌氧产气剂耗去罐内的氧气使罐内形成厌氧环境用于肠道厌氧菌培养,并把该厌氧培养罐置于37℃电热恒温鼓风干燥箱中培养48h,培养混合物用21mL水饱和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度为1500r/min离心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,为代谢48h的样品溶液。另外称取0.0761g地奥心血康胶囊内容物直接加入63mL水饱和正丁醇并搅拌使药物尽可能溶解,以速度为1500r/min离心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,作为没有粪便和厌氧培养液的样品溶液。再取大鼠新鲜粪便,称量得17.9g,按照1g∶5mL的比例将粪便与89.5mL厌氧培养液混合,搅拌制成悬浊液,用医用纱布过滤后取63.0mL肠菌培养液,该肠菌培养液不加药物直接用21mL水饱和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度为1500r/min离心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,作为没有药物的空白溶液。2.6代谢前后成分转化及代谢产物的检测5%磷钼酸乙醇试剂与具有还原性的化合物、类脂体、生物碱、甾体都能发生作用产生反应并显蓝色至深蓝色分别用5μL定量毛细管对2.5中得出的定容至5mL的溶液取样,并在0.5mm厚的硅胶H薄层板上点样,再用不同展开系统作展开剂(先预饱和30min),以1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂或5%磷钼酸乙醇试剂作为显色剂,对药物代谢前后的成分转化及代谢产物作出检测。2.7地奥血康胶囊内容的识别2.7.1泡沫试验取地奥心血康胶囊内容物少许加适量蒸馏水溶解,置具塞试管中,强烈振摇1min,产生大量的持久性泡沫。2.7.2氯仿-高硫酸反应取地奥心血康胶囊内容物少许加适量氯仿溶解,滴加几滴浓硫酸后,在氯仿层呈现紫红色,在浓硫酸呈现淡绿色。3结果与讨论3.1显色剂的转化药物代谢前的薄层色谱见图1,其中,A展开剂为氯仿∶甲醇∶水=65∶20∶2;显色剂为5%磷钼酸乙醇;B展开剂为氯仿∶甲醇∶水=65∶20∶2;显色剂为1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂;C展开剂为氯仿∶甲醇∶水=75∶35∶4;显色剂为1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂;D展开剂为乙酸乙酯∶石油醚=4∶6;显色剂为5%磷钼酸乙醇。从图1中可以看出,药物经肠内菌代谢24h后,许多成分(主要为皂苷类)都已经明显发生转化(A);药物经肠内菌代谢24h后,药物中的对1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂显色的甾体皂苷成分都已经明显发生转化(B、C);药物中的某种非极性成分在经肠内菌代谢24h并没有发生多大变化,但在代谢48h后却发生了明显的转化(D)。这些根据都说明了地奥心血康胶囊内容物的肠内菌代谢已经代谢成功。3.2醛盐酸试剂试剂药物代谢后(代谢产物)的薄层色谱见图2,其中,A展开剂为乙酸乙酯∶石油醚=4∶6;显色剂为1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂;B展开剂为乙酸乙酯∶石油醚=2∶8;显色剂为1%对二甲氨基苯甲醛盐酸试剂。从图2中可以看出,药物经肠内菌代谢24h、48h以后,在Rf=0.691的地方都出现了比较明显的紫红色斑点,在Rf=0.016的地方也出现较模糊的紫红色斑