版中国药典微生物限度检查方法验证方案

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：文件编号修订缘由修订日期TS-VP-4201-00文件编号修订缘由修订日期TS-VP-4201-00按GMP〔2023年〕要求制定质量部本文件依据需要应分发于以下部门：颁发01质量部名目概述验证目的和范围组织及职责验证进度打算表验证所需要的仪器设备及相关文件确实认验证所需要的菌种、培育基、检验样品确实认验证工程和验证方法试验菌株需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法掌握菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法偏差与漏项掌握验证报告会审概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查工程为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2023版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：掌握菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所承受的微生物限度检查方法适用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案依据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进展试验，依据验证结果判断是否符合验证标准。验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进展评价，保证检验结果的牢靠性。本验证方案3GMP组织及职责验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后QC的培训记录归档。验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进展评估并实行相应的掌握措施。姓名部门及职务姓名部门及职务职责黄汉质量负责人/质量受权人负责验证方案及报告的批准胡建QA审核验证方案、审核验证报告并协调工作曾凤敏QC负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作刘红华QC负责验证方案起草、具体实施、报告工作验证进度打算表本次微生物限度检查方法验证的打算安排时间是20231220231验证所需要的仪器设备及相关文件确实认序仪器设备名称序仪器设备名称型号编号校准单位校准日期有效期至号1号1电子天平2生化培育箱3生化培育箱4生化培育箱立式压力蒸汽5灭菌锅生物干净安全6柜检查人/日期：复核人/日期：文件名称文件编码文件名称文件编码是否有效版本文件保存处《人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准》□是□否质量部《人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程》□是□否质量部《取样操作规程》□是□否质量部《微生物限度检查操作规程》□是□否质量部《微生物试验室清洁消毒操作规程》□是□否质量部《培育基的治理制度》□是□否质量部□是□否质量部《LDZX-30FBS作规程》□是□否质量部《SPX-150B生化培育箱操作规程》□是□否质量部《BHC-1300IIA/B3规程》□是□否质量部《JJ200电子天平操作规程》□是□否质量部检查人/日期：复核人/日期：验证所需要的菌种、培育基、检验样品确实认序号菌种名称序号菌种名称代码批号来源1金黄色葡萄球菌CMCC〔B〕260032铜绿假单胞菌CMCC〔B〕101043枯草芽孢杆菌CMCC〔B〕635014白色念珠菌CMCC〔F〕980015黑曲霉CMCC〔F〕98003中国食品药品检定争论院中国食品药品检定争论院中国食品药品检定争论院中国食品药品检定争论院中国食品药品检定争论院中国食品药品检定争论院中国食品药品检定争论院6大肠埃希菌CMCC〔B〕44102中国食品药品检定争论院乙型副伤寒沙CMCC〔B〕500947中国食品药品检定争论院门菌序号名称生产厂家序号名称生产厂家是否通过培育批号基适用性试验01胰酪大豆胨液体培育基北京三药科技开发公司□是□否02胰酪大豆胨琼脂培育基北京三药科技开发公司□是□否03沙氏葡萄糖液体培育基北京三药科技开发公司□是□否04沙氏葡萄糖琼脂培育基北京三药科技开发公司□是□否05麦康凯液体培育基北京三药科技开发公司□是□否06麦康凯琼脂培育基北京三药科技开发公司□是□否07RV北京三药科技开发公司□是□否08木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基北京三药科技开发公司□是□否09三糖铁琼脂培育基北京三药科技开发公司□是□否检查人/日期：复核人/日期：序号品名生产厂家序号品名生产厂家批号规格GMP要求生产123人工牛黄甲硝唑佛山市华普生药业0.2g□是□否胶囊5mg人工牛黄甲硝唑佛山市华普生药业0.2g□是□否胶囊人工牛黄甲硝唑佛山市华普生药业5mg0.2g□是□否胶囊5mg检查人/日期：复核人/日期：验证工程和验证方法试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；掌握菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤5学特性。需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的颖培育物至10ml胰酪大豆胨液体培育基中，30～3518～241ml加0.99ml1010-5～10-750～100cfu/ml接种白色念珠菌的颖培育物至10ml沙氏葡萄糖液体培育基中，20～25℃培育2～3天，取此培育液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，承受10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。接种黑曲霉的颖培育物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培育5～7天，直到获得丰富的孢子。参加3～5ml0.05800.9%1ml有0.0580的0.99m1010-～10-7制成5～100cfu/m菌液制备后假设在室温下放置，应在2小时内使用；假设保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液2～8℃,在验证过的贮存期内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进展验证。需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。试验组1：101ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，马上倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培育箱中培育3天〔金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌〕，5〔白色念珠菌、黑曲霉〕，点计菌落数。另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，马上倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培育箱中培育5取1：10的供试液1ml注入平皿中，马上倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀，平行制备230～355另取1：10的供试液1ml45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基培育基20ml混匀，平220～255取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，马上倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培育箱中培育3天〔金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌〕，或培育5〔白色念珠菌、黑曲霉〕，点计菌落数。另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，马上倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基培育基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃5常规倾注平皿法方法验证的承受标准0.5?2围内。常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株代均均均回收率1 2 1 2 1 2数 值 值 金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株代均均均回收率1 2 1 2 1 2数 值 值 金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株代均均均回收率1 2 1 2 1 2数 值 值 金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：5菌供试品比照菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株代均均均回收率1 2 1 2 1 2数 值 值 白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：2：菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株代均均均回收率1 2 1 2 1 2数 值 值 白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：3：菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的菌供试品比照试验组 菌液比照组种 组 试验菌的试验菌株代均均均回收率1 2 1 2 1 2数 值 值 白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结依据验证方案的要求进展试验，假设各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液50ml500/3试验组取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次〔100ml/次〕，然后在第3次冲洗液〔100ml0.9%无菌氯化钠溶液〕中参加7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育3天〔金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌〕，或培育5天〔白色念珠菌、黑曲霉〕，点计菌落数。供试品比照组取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次〔100ml/次〕，平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～355菌液比照组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，200ml通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中参加7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育3天〔金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌〕，或培育5天〔白色念珠菌、黑曲霉〕，点计菌落数。稀释剂比照组依照7.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500/3取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次〔100ml/次〕，每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上，30～35℃倒置培育3〔〕或5〔白色念珠菌、黑曲霉〕，点计菌落数。离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的承受标准试验组菌落数减去供试品比照组菌落数的值与菌液比照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0.5?2范围内，同时稀释剂比照组与菌液比照组菌落数的比值应也在0.5?2范围内。离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：培育箱型号编号；培育温度：；培育时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌35株种代均均组均数12值1121值2值金黄色葡萄球菌铜绿假枯草芽白色念菌组 菌组 组 组人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：菌组 组 菌组 组 组菌种 组 株组株代均均均1 2 1 1 2 12数 值 值 值 率金黄色菌枯草芽白色念珠菌白色念珠菌试验人/日期：复核人/日期：3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号：菌组 组 菌组 组 组株种代均均组均数12值1121值2值金黄色葡萄球菌铜绿假枯草芽白色念试验人/日期：复核人/日期：离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结依据验证方案的要求进展试验，假设试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，稀释剂比照组各试验菌株0.5～2唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进展需氧菌总数计数。掌握菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.3甲硝唑胶囊有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进展需氧菌总数检查，则为了确保掌握菌检查的牢靠性，承受可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进展掌握菌检查，依据以下方案进展方法学验证。试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的掌握菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选择这两种菌5以保证试验菌株的生物学特性。掌握菌检查方法验证的菌液制备10ml30～35℃培育18～24小时，取此培育液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，承受10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml菌液制备后假设在室温下放置，应在2小时内使用；假设保存在2～8℃，可在24小时内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进展验证。大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液贮50ml500/4取供试液10ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次〔100ml/次〕，然后在第3次冲洗液〔100ml0.9%无菌氯化钠溶液〕中参加～100cfu的大肠埃希菌，过100ml30～3518～24取上述增菌培育物1ml接种至100ml麦康凯液体培育基中,42～44℃培育24～48小时。取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～72小时。麦康凯琼脂培育基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。组～100cfu/ml500/3取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次〔100ml/次〕。取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～3518～24取上述增菌培育物1ml接种至100ml麦康凯液体培育基中,42～44℃培育24～48小时。取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～72小时。麦康凯琼脂培育基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～3518～24试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:过程增菌培育过程增菌培育选择培育分别培育胰酪大豆胨液体培麦康凯液体培养麦康凯琼脂培育基培育基养基基平板配制批号配制批号配制批号结果判型号编号型号编号型号编号断培育箱温度℃温度℃温度℃间开头月日时开头月日时开头月日时完毕月日时完毕月日时完毕月日时试验组阳性阴性比照组试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:过程增菌培育过程增菌培育选择培育分别培育胰酪大豆胨液体培麦康凯液体培养麦康凯琼脂培育基培育基养基基平板配制批号配制批号配制批号结果判型号编号型号编号型号编号断培育箱温度℃温度℃温度℃间开头月日时开头月日时开头月日时完毕月日时完毕月日时完毕月日时试验组阳性比照组阴性阴性试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:过程增菌培育过程增菌培育选择培育分别培育胰酪大豆胨液体培麦康凯液体培养麦康凯琼脂培育基培育基养基基平板配制批号配制批号配制批号结果判型号编号型号编号型号编号断培育箱温度℃温度℃温度℃间开头月日时开头月日时开头月日时完毕月日时完毕月日时完毕月日时试验组阳性阴性比照组试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法验证结果小结依据验证方案的要求进展试验，假设试验组与阳性比照组均检出典型大肠埃希菌，阴性比照组无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进展检查。菌检查方法验证7.5.4.110g0.9100ml1:10500/4取全部上清液为供试液。7.5.4.2.试验组100ml0.90.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次〔100ml/次〕。然后在第3次冲洗液〔100ml0.9%无菌氯化钠溶液〕中参加～100cfu的乙型副伤寒沙门200ml30～3518～24取上述增菌培育物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培育基,30～35℃培育18～24小时。取少量RV沙门菌增菌液体培育物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～48沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透亮或半透亮、中心有或无黑色。用接种针选择出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培育基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培育18～24小时。阳性比照组～100cfu/ml500/3取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次〔100ml/次〕。取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～3518～24取上述增菌培育物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培育基,30～35℃培育18～24小时。取少量RV沙门菌增菌液体培育物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上，30～35℃培育18～48沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透亮或半透亮、中心有或无黑色。用接种针选择出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培育基高层斜面上进18～24阴性比照组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，全量通过薄膜〔孔径0.45μm混合纤维素膜〕后，取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，30～3518～24离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:过增菌培育选择培育过增菌培育选