PCR技术及其应用课件

第八章PCR技术及其应用1ppt课件.第八章PCR技术及其应用1ppt课件.PCR技术的建立Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想—“修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……2ppt课件.PCR技术的建立Khorana(1971)等提出在体外经DN1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现Mullis的构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段3ppt课件.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的94℃变性50-65℃退火XX℃延伸4ppt课件.94℃变性50-65℃退火XX℃延伸4ppt课件.94℃55℃37℃5ppt课件.94℃55℃37℃5ppt课件.TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术6ppt课件.TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶72℃94℃55℃PCR循环7ppt课件.72℃94℃55℃PCR循环7ppt课件.KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案。”这是PCR的发明者Mullis在1991年对《研究与发展》杂志(R&D)记者说的一番话8ppt课件.KaryB.Mullis<<TheUnu第一节PCR技术原理和

工作方式第八章PCR技术及其应用9ppt课件.第一节PCR技术原理和

工作方式第八章PCR技术及其应用一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。10ppt课件.一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制10ppt课件.11ppt课件.11ppt课件.PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；12ppt课件.PCRCycle-Step1-DenaturatPCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；13ppt课件.PCRCycle-Step2–

TemperaPCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。14ppt课件.PCRCycle-Step3-

At72Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。15ppt课件.Endofthe1stPCRCycle–

RPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

16ppt课件.PCR的基本原理PCR反应条件重复30轮后模板DNA第1轮扩TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon17ppt课件.TargetAmplificationNo.of No.1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍18ppt课件.1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应二、PCR反应体系缓冲液dNTP引物模版DNA聚合酶19ppt课件.二、PCR反应体系缓冲液19ppt课件.1.缓冲液标准的缓冲液含10mMTris·HClpH为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72℃）下，pH值接近7.2缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+

，有时使用Mn2+

缓冲液中还含有50mM的钾离子有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含G+C模板的扩增效率。20ppt课件.1.缓冲液标准的缓冲液含10mMTris·HCl20Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。一般以MgCl2的形式提供，标准浓度为1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率21ppt课件.Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。21ppt课件.2.dNTP脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，终浓度一般为200mM（即饱和浓度）浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。22ppt课件.2.dNTP脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物22ppt3.引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1mM，即1pmol/ml浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降23ppt课件.3.引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1mM，引物设计原则①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。③G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。24ppt课件.引物设计原则①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。25ppt课件.④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身26ppt课件.26ppt课件.27ppt课件.27ppt课件.28ppt课件.28ppt课件.29ppt课件.29ppt课件.30ppt课件.30ppt课件.4.模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。用人类或哺乳动物基因组DNA进行扩增时，一般使用1μgDNA以酵母菌、细菌、质粒和M13噬菌体噬菌斑的DNA作模板时，分别需要10ng，1ng，1pg和1%噬菌斑。31ppt课件.4.模板单、双链DNA均可。31ppt课件.5.DNA聚合酶①TaqDNA聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermusaquaticus），TaqDNA聚合酶分子量大小为94kDa，为单分子酶，在75℃活性最强。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,但是无3’-5’外切活性。由于没有3'-5'外切活性，在扩增过程中有8.9-11x10-5

的错配几率。在95℃的半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很强，聚合速度快，在72℃的聚合速度为每秒30-100碱基。32ppt课件.5.DNA聚合酶①TaqDNA聚合酶32ppt课件.②TthDNA聚合酶TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌（Thermusthermophilus）HB8，由Promega公司开发成商品。TthDNA聚合酶分子量为94kDa，在74℃进行扩增，在95℃的半衰期为20分钟。在Mg2+

存在条件下以DNA为模板合成DNA，而在MnCl2

存在下可以RNA为模板合成cDNA。因此可在高温下做RT-PCR、反转录和引物延伸（primerextension）反应，避免RNA反转录过程中形成的二级结构。33ppt课件.②TthDNA聚合酶33ppt课件.③VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶是从由火山口分离的嗜热球菌Thermococcuslitoralis中分离的第一个具有3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶，由NewEnglandBlabs公司开发出商品。酶分子为85kDa，具有更长的半衰期，在100℃（使用MgSO4）时，其半衰期为1.8小时。34ppt课件.③VentDNA聚合酶34ppt课件.④PwoDNA聚合酶PwoDNA聚合酶来自Pyrococcuswoesei（BM），大小为90kDa，由原德国宝灵曼公司开发。在100℃的半衰期大于2小时，出错率低。是使用较多的具有3'-5'外切活性的且具有高保真度的PCR酶。35ppt课件.④PwoDNA聚合酶35ppt课件.⑤PfuDNA聚合酶PfuDNA聚合酶来自激烈热球菌具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有3'-5'外切活性的PCR酶。⑥商用混合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长的DNA片段，将TaqDNA聚合酶的强启动能力和具有3'-5'外切活性的高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。36ppt课件.⑤PfuDNA聚合酶36ppt课件.三、PCR反应程序（1）变性使双链DNA解链为单链95℃20-30秒

(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。37ppt课件.三、PCR反应程序（1）变性37ppt课件.（3）延伸70-75℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加38ppt课件.（3）延伸38ppt课件.PCR反应中的注意事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分39ppt课件.PCR反应中的注意事项（一）防止污染39ppt课件.第二节PCR产物的克隆第八章PCR技术及其应用40ppt课件.第二节PCR产物的克隆第八章PCR技术及其应用40ppt一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点为了使PCR产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点设计引物：正常的特异性序列、在引物的5‘末端添加酶切位点、保护序列、在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在。如果对扩增的DNA片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为8个碱基序列的酶切位点。41ppt课件.一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点为了使PCR产物二、A/T克隆法TaqDNA聚合酶具有末端转移酶的活性可在DNA片段的3‘末端添加一个核苷酸，通常为A。因此TaqDNA聚合酶扩增的产物可与T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的T-载体最初由Promega公司开发出商品，并一直沿用到现在，如和pGEM-TEasy42ppt课件.二、A/T克隆法TaqDNA聚合酶具有末端转移酶的活性443ppt课件.43ppt课件.在DNA的3’末端添加一个T碱基的方法:如用末端转移酶和底物ddTMP可以产生单个T的突出末端有些识别不对称序列的限制性内切酶，如MboⅡ、XcmⅠ和HphⅠ，在切割DNA后可直接产生一个3’突出的T用TaqDNA聚合酶和高浓度的dTTP也可产生3'突出的T44ppt课件.在DNA的3’末端添加一个T碱基的方法:44pp45ppt课件.45ppt课件.三、平末端DNA片段的克隆1pPCR-ScriptAmpSK（+）克隆载体该载体从pBluescriptⅡSK（+）噬菌粒改造而来，将多克隆位点中的

XbaⅠ和SpeⅠ位点改成

SrfⅠ位点（5′-GCCC/GGGC-3′）。克隆DNA片段时，先将载体用SrfⅠ切成线状，再与目标DNA片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加T4DNA连接酶外，还加入SrfⅠ酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后，SrfⅠ酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中只有当载体与目标DNA片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目标DNA片段连接这个方向倾斜。46ppt课件.三、平末端DNA片段的克隆1pPCR-ScriptAmp2pCR-Blunt克隆载体pCR-Blunt载体最大特点是在lacZ’基因的下游融合了一个ccdB基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为3.5kb，含卡那霉素抗性基因和Zerocin抗性基因在克隆外源平末端DNA片段时，先将改载体切成线状，再与目标DNA连接，转化大肠杆菌如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源DNA片段与载体连接后，ccdB基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。47ppt课件.2pCR-Blunt克隆载体47ppt课件.四、长片段DNA的PCR扩增在长片段的PCR扩增过程中高温会降低缓冲液的缓冲能力，从而损害模板DNA和PCR产物在高温下其它二价离子的存在会促进DNA的裂解长片段DNA分子的变性比短片段困难DNA聚合酶与模板DNA的趋近和结合变得困难错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度。48ppt课件.四、长片段DNA的PCR扩增在长片段的PCR扩增过程中4为了提高扩增产物的长度一方面改进缓冲体系另一方面采用混合DNA聚合酶即主体使用扩增效率高、延伸能力强的TaqDNA聚合酶；少量使用具有3‘-5’外切活性的高温DNA聚合酶（如Pfu或PwoDNA聚合酶），及时切除不匹配碱基的掺入这样可使扩增长片段DNA有效实施,可扩增长达40kb的DNA片段49ppt课件.为了提高扩增产物的长度49ppt课件.第三节PCR扩增未知DNA片段第八章PCR技术及其应用50ppt课件.第三节PCR扩增未知DNA片段第八章PCR技术及其应用5一、反向PCR二、利用接头的PCR三、热不对称交错PCR51ppt课件.一、反向PCR51ppt课件.一、反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列52ppt课件.一、反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶53ppt课件.已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶53ppt课件.二、利用接头的PCR54ppt课件.二、利用接头的PCR54ppt课件.三、热不对称交错PCRTAIL-PCR(TermalAsymmetricInterlacedPCR)目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。用途制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究，染色体步查55ppt课件.三、热不对称交错PCRTAIL-PCR(TermalAsy在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物(2)由同一特异性引物扩增出的产物(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，其中后2种产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

56ppt课件.在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成56p原理TAIL-PCR的基本原理利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp)用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp)相组合以基因组DNA为模板．根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物57ppt课件.原理TAIL-PCR的基本原理57ppt课件.步骤TAIL-PCR共分3次反应。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。58ppt课件.步骤TAIL-PCR共分3次反应。58ppt课件.经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物特异性产物(I)型和非特异性产物(II型和III型)。第二次反应将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应将第二次反应的产物稀释作模板再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列59ppt课件.经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物59ppt课件.60ppt课件.60ppt课件.61ppt课件.61ppt课件.应用Gento等曾用构建的含有潮霉素抗性基因(hph)的双元表达载体pBIG2RHPH2转化真菌然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌转化子基因组DNA的T-DNA插入区的旁侧序列根据T-DNA区的HPH基因设计了扩增右边界的3个引物HS1～HS3，以及扩增左边界的引物HAS2～HAS4，另外又根据不同的转化子分别设计了简并引物ADl～AD362ppt课件.应用Gento等曾用构建的含有潮霉素抗性基因(hph)的双元63ppt课件.63ppt课件.第四节与反转录相关的PCR第八章PCR技术及其应用64ppt课件.第四节与反转录相关的PCR第八章PCR技术及其应用64p一、cDNA末端的快速扩增RACERapidamplificationofcDNAend5’-RACE3’-RACE65ppt课件.一、cDNA末端的快速扩增RACE65ppt课件.5’-RACEAAAAA······CCCCCCGGGGGG66ppt课件.5’-RACEAAAAA······CCCCCCGGGGGG巢式PCR67ppt课件.巢式PCR67ppt课件.二、差异显示PCRDD-PCR流程图68ppt课件.二、差异显示PCRD68ppt课件.第五节PCR产生DNA指纹第八章PCR技术及其应用69ppt课件.第五节PCR产生DNA指纹第八章PCR技术及其应用69p一、多重PCR二、RAPD——随机扩增多态性PCR三、RFLP四、AFLP——扩增片段长度多态性PCR70ppt课件.一、多重PCR70ppt课件.一、多重PCR在一个反应体系中使用一对以上的引物用于等位基因的鉴定对每种类型的基因设计特异性的PCR引物，并且产物大小彼此不同通过扩增产物的大小判断样品中基因类型检测特定基因序列的存在或缺失71ppt课件.一、多重PCR在一个反应体系中使用一对以上的引物71ppt课电泳引物72ppt课件.电泳引物72ppt课件.DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：正常强度的一半病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失73ppt课件.DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对二、RAPD标记随机扩增多态性PCRrandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD1990年，由美国杜邦公司的科学家Williams推出RAPD方法是在PCR技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为10个核苷酸），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，引物与基因组DNA某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游DNA进行合成，即扩增。74ppt课件.二、RAPD标记随机扩增多态性PCR74ppt课件.1.RAPD的基本概念和原理RAPD的引物（1）为随机引物（2）序列较短（通常为10个核苷酸）（3）为一个寡核苷酸单链引物75ppt课件.1.RAPD的基本概念和原理RAPD的引物75ppt课件.0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系276ppt课件.0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb2.RAPD的基本实验程序1.DNA的提取（1）碱法（2）CTAB法（3）SDS法2.模板DNA浓度和质量的检测3.PCR扩增4.电泳检测：PCR结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液，每个泳道点样20ul。5.凝胶观察、拍照。6.统计分析：记录条带清晰的RAPD条带，计算带纹相似率；计算DNA片段大小等。77ppt课件.2.RAPD的基本实验程序1.DNA的提取77ppt课件3.RAPD结果78ppt课件.3.RAPD结果78ppt课件.4.RAPD的优点优点：（1）不需DNA探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖整个基因组。具有广泛适用性和通用性（2）用一个引物可扩增出多片段（3）技术简单，需要样品量少，成本低（4）每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点，简化信息的转移过程（5）可以对RFLP难以分析的基因组区域做出遗传连锁图（6）分析自动化79ppt课件.4.RAPD的优点优点：79ppt课件.5.RAPD的缺点缺点：（1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体（2）对反应条件敏感，重复性差包括模板浓度、Mg2+浓度，PCR反应中条件的变化等（3）存在共迁移问题不同个体相同分子量的片段不一定同源；一条带可能包含不同的产物。80ppt课件.5.RAPD的缺点缺点：80ppt课件.三、RFLP标记RFLP：限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所产生的DNA片段在长度上的变化。81ppt课件.三、RFLP标记RFLP：限制性片段长度多态性81ppt课件1.RFLP原理生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确性是相对的实际上，在植物的自然群体中存在大量的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等几乎不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。限制性内切酶酶解DNA长链，是识别DNA上的特异的位点并在这些位点上切断的过程酶识别位点碱基对越少，DNA分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。82ppt课件.1.RFLP原理生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。83ppt课件.来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核DNA的RFLP84ppt课件.用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb0.3kb0.4kb0.5kb×(1)(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系20.4kb0.1kb+–85ppt课件.0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb0.3kb0.4kb2.RFLP的方法与步骤（1）DNA的分离：可用CTAB法或SDS法（2）酶切：一般根据基因组总DNA的复杂性选用限制酶。（3）琼脂糖凝胶电泳（4）Southern印迹转移（5）DNA杂交及放射自显影86ppt课件.2.RFLP的方法与步骤（1）DNA的分离：可用CTAB法3.RFLP的优点优点（1）不受性别、年龄局限，不会受表达的组织、发育阶段或外界环境的不同而受影响（2）标记座位的等位基因间是共显性的，通过杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性纯合子（3）RFLP标记源于基因组DNA自身变异，在数量上几乎不受限制。87ppt课件.3.RFLP的优点优点87ppt课件.4.RFLP的缺点缺点（1）DNA需要量大。5~10µg（2）所需一起较多（3）技术较为复杂（4）大多数RFLP表现为二态性，杂合率低于50%，所提供的信息量较低（5）与内切酶选用密切相关88ppt课件.4.RFLP的缺点缺点88ppt课件.四、AFLP标记AFLP：扩增片段长度多态性amplifiedfragmentlengthpolymorphism

AFLP技术是1992年由荷兰Keygene公司的科学家ZabeauMare和VosPieter发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。89ppt课件.四、AFLP标记AFLP：扩增片段长度多态性89ppt课件.1.AFLP的基本原理植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段随后将特定的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增最后通过PAGE分离扩增的特异限制性片段在不需要DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。90ppt课件.1.AFLP的基本原理植物基因组DNA经限制性内切酶消化形AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为18~20个核苷酸。引物主要由3部分组成：（1）核心序列（CORE），该序列与人工接头互补；（2）限制性内切酶识别特异序列（ENZ）；（3）选择性延伸序列（EXT），即引物3端的选择碱基，选择碱基延伸到酶切片段区。如：EcoRI引物和MseI引物COREENZEXTEcoRI5´-GACTGCGTACCAATTCNNN-3´MseI5´-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3´91ppt课件.AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为18~22.AFLP的优缺点优点：（1）少量引物可获得较多标记，50~150条带（2）多为显性标记或共显性标记，受环境影响小，无复等位效应（3）带型清晰，具高分别率（4）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带纹丰富，灵敏度高，重复性好（5）不需事先知道DNA序列信息缺点：操作复杂，费用较高92ppt课件.2.AFLP的优缺点优点：92ppt课件.五、SSR标记SSR：简单重复序列多态性，也叫微卫星标记simplesequencerepeat微卫星：即短串联重复(Short

Tandem

Repeat，STR)它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常多态性片段长度在100-300bp以人类基因组为例，平均每15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约有50,000-100,000个STR位点。由于微卫星DNA具有高度的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学DNA分子标记93ppt课件.五、SSR标记SSR：简单重复序列多态性，也叫微卫星标记93六、ISSR标记ISSRinter-simplesequencerepeat是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记94ppt课件.六、ISSR标记ISSR94ppt课件.其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2-4个随机核昔酸在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增所扩增的interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。95ppt课件.其基本原理是95ppt课件.ISSR的优点ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。96ppt课件.ISSR的优点ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得第六节实时定量PCR第八章PCR技术及其应用97ppt课件.第六节实时定量PCR第八章PCR技术及其应用97ppt课荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量荧光定量PCR仪光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。98ppt课件.荧光定量PCR（real-timePCR)98ppt课件一、实时荧光定量PCR的定量方式99ppt课件.一、实时荧光定量PCR的定量方式99ppt课件.100ppt课件.100ppt课件.101ppt课件.101ppt课件.荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。102ppt课件.荧光阈值102ppt课件.103ppt课件.103ppt课件.二、荧光标记方式内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针原理：DualProbes(FRET)（荧