牙龈卟啉单胞菌合成环二腺苷酸的高效液相色谱

牙龈卟啉单胞菌合成环二腺苷酸的高效液相色谱-串联质谱法定性分析谭咏梅;杨小军;杜娟;赵望泓;陈晓丹;侯晋【摘要】目的：定性检测牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)是否能产生细菌信号分子环二腺苷酸(c-di-AMP)，为探索其在P.gingivalis生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。方法以P.gingivalis标准菌株ATCC33277为实验菌株，抽提细菌内核酸物质作为样品，配置c-di-AMP标准品，通过高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)和高效液相色谱法(HPLC)对样品进行验证。结果HPLC-MS/MS检出限按照信噪比(S/N)3:1计算，c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49min,P.gingivalis提取物样品在保留时间为8.82min时有目标峰出现(大于3S/N)。HPLC检测结果表明，P.gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7min处出现目标峰，且二者的紫外吸收光谱相同。结论牙龈卟啉单胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP，牙龈卟啉单胞菌可以合成产生c-di-AMP。％ObjectiveTotestwhetherPorphyromonasgingivalis(P.gingivalis)couldproducebacterialsignalmolecule,bis-(3'-5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate(c-di-AMP)andlaythefoundationforexplorationsofitsrolesinlifemetabolismandperiodontitisimmunityofP.gingivalis.MethodsP.gingivalisstandardstrainATCC33277wasusedastheexperimentalstraintoextractnucleicacidsfromthebacteria.Then,c-di-AMPwasdetectedusinghighperformanceliquidchromatographycoupledwithmassspectrometry(HPLC-MS/MS).Subsequently,HPLCwasusedtovalidatethesamplefurther.ResultsBasedonthesignal/noise(S/N)for3:1,thelimitofdeterminationofHPLC-MS/MSforpeaktimeofc-di-AMPstandardsubstanceswas7.49minandnucleicacidextractionsfromP.gingivaliswas8.82min(S/N>3).FurtherconfirmationofHPLCshowedthatnucleicacidextractionsfrombothP.gingivalisandc-di-AMPstandardsubstancespresentedgoalabsorbentpeaksat15.7min,withthesameultravioletabsorbentspectrum.ConclusionThenucleicacidextractionsfromP.gingivaliscontainedc-di-AMP,whichshowsthatP.gingivaliscouldproducec-di-AMP.【期刊名称】《华西口腔医学杂志》年(卷),期】2016(034)003【总页数】5页(P307-311)【关键词】环二腺苷酸;牙龈卟啉单胞菌;高效液相色谱-串联质谱法【作者】谭咏梅;杨小军;杜娟;赵望泓;陈晓丹;侯晋【作者单位】南方医科大学南方医院口腔科;南方医科大学南方医院口腔科;南方医科大学公共卫生与热带医学学院卫生监测中心，广州510515;南方医科大学南方医院口腔科;汕头大学医学院第二附属医院口腔科，汕头515041;南方医科大学南方医院口腔科【正文语种】中文【中图分类】R780.2Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81500870);PresidentFoundationofNanfangHospital,SouthernMedicalUniversity(2013Z006,2012C005).Correspondence:HouJin,E-mail:.cn.环二鸟苷酸［bis-(3'-5')-cyclicdimericguano-sinemonophosphate,c-di-GMP］和环二腺苷酸［bis-(3'-5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate，c-di-AMP］是近年来新发现的，在细菌和古细菌中广泛存在的信号分子［1-2］。目前的研究结果显示，c-di-GMP作为第二信使，在细菌的蠕动、毒力因子的表达、生物膜的形成、细胞周期、细胞间通讯以及细菌对宿主细胞的入侵等过程中发挥着重要的调节作用，是细菌生存和代谢的关键性调节因子之一［3-5］。与c-di-GMP相比，c-di-AMP的发现较晚，研究相对较少，因此对其功能了解十分有限。现有研究结果显示，c-di-AMP与细菌肽聚糖稳态、细胞耐药性、细菌大小、生物膜形成、肺炎链球菌菌链的长度以及细菌感染有着密切的关系，并且其在不同的菌种中发挥着不同的调节功能［6］。c-di-AMP是通过二腺苷酸环化酶(diadenylatecyclase，DAC)由两分子的ATP或ADP合成而来，而其降解代谢与c-di-GMP-样都是通过磷酸二酯酶来完成。2008年Witte等［7］在研究细菌的Checkpoint蛋白DisA的过程中发现，该蛋白结构中有一个未知功能的结构域147(domainofunknownfunction147,DUF147)，其具有二腺苷酸环化酶的活性，能将两分子的ATP合成一分子的环二磷酸腺苷，因此该结构域又被命名为DAC结构域。由于该结构域多耦联于DisA蛋白中，并且位于DisA蛋白的氨基端，所以又被称为DisA_N结构域。Pfam数据库中的数据显示，11352个物种中都含有DisA_N结构域。说明c-di-AMP这个信号分子在细菌中广泛存在。通过常规的生物学方法敲除c-di-AMP的合成蛋白基因会导致多种细菌死亡，提示c-di-AMP在细菌的生命代谢过程中发挥着重要作用，是细菌生长所必需的信号分子。除此之外，c-di-AMP还可以作为病原相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)被宿主细胞内的模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRs)特异性识别，激活宿主的固有免疫应答反应［2］。虽然研究者已经在枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis）［8］、李斯特菌（Listeriamonocytogenes）［9］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［10］以及乳酸球菌（Lactococcuslactis）［11］等细菌的核酸提取物中检测到了c-di-AMP的存在，但有关牙周炎致病菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）中c-di-AMP的研究迄今为止未见报道。本研究的目的是通过高效液相色谱-串联质谱法（highperformanceliquidchromatographycoupledwithmassspectrometry，HPLC-MS/MS）和高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）定性检测P.gingivalis是否能产生细菌信号分子c-di-AMP，为探索c-di-AMP在P.gingivalis生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。实验细菌P.gingivalisATCC33277菌株购自美国Microbiologics公司。主要试剂及仪器胰酶大豆肉汤（TrypticSoyBroth，TSB）培养基、L-盐酸半胱氨酸、氯化血红素、维生素K3（Sigma公司，美国），无菌脱纤维绵羊血（广州蕊特生物科技有限公司），c-di-AMP标准品（Invivogen公司，美国），色谱纯甲醇、乙腈（Merck公司，德国）。AnoxomatMark口厌氧微需氧培养系统（MART公司，荷兰），电子天平（Sartorius公司，德国），正置相差显微镜及照相系统（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海振阳设备有限公司），离心机（Therm。公司，美国），AB4000液相色谱串联质谱联用仪（MDSSciex公司，美国），氮吹仪（Organomation公司，美国），API4000QTrapHPLC-MS/MS联用仪配有Agilent1200高效液相色谱（AgilentTechnologies公司，美国），Shim-packXR-ODS色谱柱（岛津公司，日本），PhenomenexC-18色谱柱（Phenomenex公司，美国）。1.3细菌培养将P.gingivalisATCC33277复苏后接种于TSB血琼脂培养基（含50mL・L-1冻溶羊血、0.5g・L-1L-盐酸半胱氨酸、5mg・L-1氯化血红素和1mg・L-1维生素K3）,37°C厌氧培养（80%N2、10%CO2、10%H2）。样品的提取与纯化样品提取的方法参考文献［12-13］。取5mL对数生长期（OD6905.8）的细菌菌液，4C、2500g离心20min，弃上清，加入1mL的培养基重悬细菌沉淀物，4C、2500g离心20min，弃上清，往沉淀中加入300pL的提取液（乙腈：甲醇：水=2:2:1）,冰上孵育15min，放入95C加热10min后立即在冰上冷却，4C、20800g离心10min，将上清转移到另一支2mL的离心管中。再往细菌沉淀物中加入200pL的提取液，冰上孵育15min,4C,20800g离心10min，收集上清（该步骤重复2次）。将所获得的上清-20C冷冻过夜。次日，4C、20800g离心10min，收集上清。将获得的核酸提取物样品在氮气流中吹干，用甲醇复溶，上机检测。c-di-AMP标准品溶液的配制在c-di-AMP标准品中加入1mL色谱级甲醇，溶解，混匀，配置成1mg・mL-1的储存液。将标准品储存液用色谱级水稀释，配成10ng・mL-1和100ng・mL-1的标准品溶液。HPLC-MS/MS检测采用HPLC-MS/MS检测样本和标准品。1）环境条件：温度15~30C,相对湿度小于等于80%。2）色谱条件。色谱柱：岛津Shim-packXR-ODS（75mmx2.0mm）;流动相：甲醇作为有机相，10mmol丄-1的醋酸铵加0.1%醋酸作为水相；流速：0.3mL・min-1;柱温：室温；进样量：5pL。质谱条件见表;离子源为ESI源，多反应监测(multiplereactionmonitoring，MRM)扫描模式，喷雾电压为5500V,离子源温度350°C,气帘气15.0kPa，离子源气体12.0kPa。HPLC检测采用HPLC对样品和标准品进一步验证。1)环境条件。温度：15~30C,相对湿度小于等于80%。2)色谱条件。色谱柱：PhenomenexC-18(150mmx4.60mm)；体系：采用A和B双泵系统，流动相A相为10%乙腈+0.1%甲酸，B相为90%乙腈；流量：1.000mL・min-1;低压限值：0.00bar;高压限值：400.00bar;梯度洗脱程序：0~20min,A:20.0%,B:80.0%；21-24min,A:0.0%B:100.0%;25-30min,A：95.0%,B:5.0%。柱温：室温；进样量：30.00U。HPLC结果以保留时间和紫外吸收光谱定性，即通过将c-di-AMP标准品的保留时间与P.gingivalis核酸提取样品进行比对，再结合相应的光谱曲线,对样品进行定性分析。2.1生物信息学检索通过生物信息检索发现，在已知基因序列的P.gingivalis菌株中具有腺苷酸环化酶活性的DisA_N结构域(表2)。已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA均包含255个氨基酸。在美国国家生物技术信息中心数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)中对已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA氨基酸序列进行比对发现，ATCC33277、TDC60和F0569的DisA蛋白具有完全相同的氨基酸序列，而其余8个菌株的DisA的氨基酸序列完全相同(表)。氨基酸序列之间的相似性为99%,两者之间只是羧基末端的第252位氨基酸不同，但DisA_N结构域的区域为8~249位氨基酸，因此该差异氨基酸并不位于DisA_N结构域内。HPLC-MS/MS检测HPLC-MS/MS检测结果见图1。HPLC-MS/MS检出限按照信噪比（S/N）3:1计算，c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49min，P.gingivalis提取物样品在保留时间为8.82min时有目标峰出现（大于3S/N），而且提取物中含有与标准品分子量一致的物质。这表明，P.gingivalis的菌体核酸提取物中含有c-di-AMP。HPLC检测HPLC检测结果见图2。P.gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在min处出现目标峰，且二者的紫外吸收光谱相同。这表明，样品中含有与标准品为同一物质的c-di-AMP。c-di-AMP是细菌中广泛存在的环二核苷酸（cyclicdinucleotides，CDNs）信号分子，由两分子的ATP或ADP在二腺苷酸环化酶的作用下合成而来。Pfam数据库中的数据显示，11352个物种中的12702种蛋白都含有具有二腺苷酸环化酶活性的DAC结构域即DisA_N结构域。该结构域常常与其他功能的结构域偶联在—起，而且不同功能结构域的组合方式已经发现的有21种之多，如DNA结合功能域、跨膜信号肽、PAS功能域、蛋白激酶功能域、磷酸化功能域以及功能未知的蛋白功能域等，说明c-di-AMP在细菌的生命代谢过程中扮演着多重角色。本研究通过生物信息检索发现在已知基因序列的牙龈卟啉单胞菌的菌株中皆存在DisA_N结构域，该结果表明牙周致病菌P.gingivalis可能会合成和分泌c-di-AMP。本研究以P.gingivalis标准株ATCC33277为实验菌株，通过HPLC-MS/MS定性检测P.gingivalis菌体提取物中是否存在c-di-AMP。实验结果显示，检出限按照信噪比（S/N）3：1计算，浓度为10ng・mL-1的c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49min,P.gingivalis提取物样品在保留时间为8.82min时有目标峰出现（大于3S/N）。因此，考虑P.gingivalis核酸提取物中可能含有c-di-AMP。由于样品与标准品出峰时间的差异，笔者采用HPLC法对样品和标准品进行进一步的验证。本研究采用乙腈和甲酸对样品进行等梯度洗脱，HPLC结果以保留时间和紫外吸收光谱定性，即通过将P.gingivalis核酸提取样品的保留时间与c-di-AMP标准品进行比对，再结合相应的光谱曲线，对该样品进行定性分析。结果显示：P.gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7min处出现目标峰，而且样品与标准品峰的紫外吸收光谱相同，因此，可以认为P.gingivalis核酸提取物中含有c-di-AMP，即P.gingivalis可以合成和分泌c-di-AMP。色质联用法在检测分析过程中还存在色谱条件优化的问题，在本研究中，c-di-AMP标准品及牙龈卟啉单胞菌核酸提取物样品两者出峰时间不同，可能是受到了基质干扰、流动相、色谱柱以及实验环境等多方面的影响，检测条件还需进一步优化。c-di-AMP作为细菌重要的信号分子，研究显示：过量的c-di-AMP可干扰枯草芽抱杆菌肽聚糖的合成［8］；在金黄色葡萄球菌和乳酸球菌中，菌胞内cdi-AMP水平的升高可帮助细菌适应极端环境［10-11］，而且菌胞内c-di-AMP水平的升高有助于金黄色葡萄球菌的生长和分裂，这表明其在细菌的生命代谢过程中发挥着重要作用。c-di-AMP除了在细菌的生命代谢过程中扮演第二信使的角色外，还可被细胞内的某些DNA受体类的PRRs识别，调节干扰素(interferon)叩介导的免疫反应的活性，引发宿主的固有免疫反应［14-17］。入侵到宿主细胞内的细菌所产生的c-di-AMP可以被宿主细胞胞浆内的一类PRRs所感知，并激活宿主细胞的I型干扰素反应［9］。本研究证明了牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌可合成c-di-AMP，但是c-di-AMP在其生命代谢中的作用，以及入侵到宿主细胞内的P.gingivalis所产生的c-di-AMP是否能激活宿主的I型干扰素反应，并在牙周炎的免疫应答反应中发挥作用，还有待于进一步的深入研究。相关文献】RyjenkovDA,TarutinaM,MoskvinOV,etal.Cyclicdiguanylateisaubiquitoussignalingmoleculeinbacteria:insightsintobiochemistryoftheGGDEFproteindomain[J].JBacteriol,2005,187(5):1792-1798.RomlingU.Greattimesforsmallmolecules:c-di-AMP,asecondmessengercandidateinBacteriaandArchaea[J].SciSignal,2008,1(33):e39.SchirmerT,JenalU.Structuralandmechanisticdeterminantsofc-di-GMPsignalling[J].NatRevMicrobiol,2009,7(10):724-735.MillsE,PultzIS,KulasekaraHD,etal.Thebacterialsecondmessengerc-di-GMP:mechanismsofsignalling[J].CellMicrobiol,2011,13(8):1122-1129.PovolotskyTL,HenggeR.‘Life-style'controlnetworksinEscherichiacoli:signalingbythesecondmessengerc-di-GMP[J].JBiotechnol,2012,160(1/2):10-16.CorriganRM,GrUndlingA.Cyclicdi-AMP:anothersecondmessengerentersthefray[J].NatRevMicrobiol,2013,11(8):513-524.WitteG,HartungS,BUttnerK,etal.StructuralbiochemistryofabacterialcheckpointproteinrevealsdiadenylatecyclaseactivityregulatedbyDNArecombinationintermediates[J].MolCell,2008,30(2):167-178.MehneFM,GunkaK,EilersH,etal.Cyclicdi-AMPhomeostasisinbacillussubtilis:bothlackandhighlevelaccumulationofthenucleotidearedetrimentalforcellgrowth[J].JBiolChem,2013,288(3):2004-2017.WoodwardJJ,IavaroneAT,PortnoyDA.c-di-AMPsecretedbyintracellularListeriamonocytogenesactivatesahosttypeIinterferonresponse[J].Scienee,2010,328(5986):1703-1705.CorriganRM,AbbottJC,BurhenneH,etal.c-di-AMPisanewsecondmessengerinStaphylococcusaureuswitharoleincontrollingcellsizeandenvelopestress[J].PLoSPathog,2011,7(9):e1002217.SmithWM,PhamTH,LeiL,etal.HeatresistanceandsalthypersensitivityinLactococcuslactisduetospontaneousmutationofllmg_1816(gdpP)inducedbyhigh-temperaturegrowth[J].ApplEnvironM