药物的含量测定-仪器分析技术（药物分析课件）

色谱分析法的含量测定计算一、头孢唑林钠含量测定取含量为99.5%的头孢唑林钠对照品25.13mg，配成溶液，取此溶液10µl注入液相色谱仪，测定峰面积，3次测定值分别为：2490189、2492796和2492178；另外称取头孢唑林钠供试品3份，分别为28.13mg、29.35mg和27.10mg，按上法测定，分别取10µl溶液注入液相色谱仪，测得峰面积分别为2634858、2763699和2536847，求供试品的百分含量。一、头孢唑林钠含量测定第一次测定：第二次测定：第三次测定：对照品平均峰面积：二、复方醋酸地塞米松乳膏（10g:7.5mg）醋酸地塞米松标示量百分含量色谱条件与系统适用性试验：固定相：C18

流动相：甲醇-水（70∶30）检测波长：240nm理论板数：按氢化可的松峰计算不低于2000分离度：地塞米松峰、内标物质峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求二、复方醋酸地塞米松乳膏（10g:7.5mg）醋酸地塞米松标示量百分含量内标溶液：甲睾酮0.0100g，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度测定法：供试品+内标记录色谱图；测得数据如下：试样峰面积供试品1874950内标物16357632二、复方醋酸地塞米松乳膏（10g:7.5mg）醋酸地塞米松标示量百分含量试样峰面积对照品18234570内标物16359828另取醋酸地塞米松对照品约0.01280g，精密称定，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；同法测定。测得数据如下：二、复方醋酸地塞米松乳膏（10g:7.5mg）醋酸地塞米松标示量百分含量供试品的标示量百分含量为95.75%

二、复方醋酸地塞米松乳膏（10g:7.5mg）醋酸地塞米松标示量百分含量色谱分析法色谱法概述色谱分析法简称色谱法或层析法，是一种物理或物理化学的分离、分析方法。是基于混合物各组分在固定相、流动相两相中吸附、分配等作用的差异而实现分离，再逐个进行定性或定量分析的方法。实质：分离目的意义：实现多组分混合物的分离分析一、色谱法的起源和发展色带固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

属于液固色谱概念：固定相流动相色谱柱1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941年，Martin和Synge提出分配色谱法1944年，Martin等又提出纸色谱法1952年，Martin和James发明了气相色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法1957年，戈雷(Golay)发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践”论文，首先提出毛细管速率方程，并第一次实现了毛细管气相色谱分离。1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱仪1975年，Small等提出离子色谱

20世纪80年代，超临界色谱20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Reŭss第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展二、色谱法的分类按两相状态不同分类按承载固定相的外形按色谱分离过程的原理不同分类按两相状态不同分类

色谱其中的一相固定不动，称为固定相;

另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。两相状态流动相的物态液相色谱（LC）气相色谱（GC）二、色谱法的分类按两相状态不同分类按承载固定相的外形按色谱分离过程的原理不同分类根据承载固定相的装置外形分柱色谱平板色谱填充柱色谱毛细管柱色谱纸色谱薄层色谱按承载固定相的外形分类柱色谱纸色谱薄层色谱二、色谱法的分类按两相状态不同分类按承载固定相的外形按色谱分离过程的原理不同分类按色谱分离过程的原理不同分类（1）吸附色谱：以固体吸附剂作为固定相，利用组分在吸附剂上吸附力的不同而实现分离（2）分配色谱：利用组分在固定相与流动相两液相体中溶解度的不同来分离（3）离子交换色谱：用离子交换树脂为固定相，利用离子交换树脂对不同离子交换能力的差异来实现分离（4）凝胶色谱法（分子排阻色谱)：以凝胶为固定相，利用不同组分在凝胶色谱中分子大小而滞留的时间不同实现分离三、色谱法的特点1、优点：“三高”、“一快”、“一广”1）高选择性：可将性质相似的组分分开2）高效能：反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果3）高灵敏度：10-11~10-13g，适于痕量分析4）分析速度快：几~几十分钟完成分离，一次可测得多种样品5）应用范围广：气体，液体、固体物质对未知物分析的定性专属性差，需要与其他分析方法联用（GC-MS，LC-MS、GC-FTIR、SFC-MS、HPLC-UV、TLC-UV等）2、缺点：色谱分析法系统适应性试验色谱系统适应性实验

是用规定的对照溶液或测试溶液对仪器进行试验和调整，应达到方法规定的要求;或规定状态下的色谱柱的最小理论塔板数N、分离度R、拖尾因子T、及相对标准偏差RSD符合要求。理论塔板数（n）分离度（R）重复性（RSD）拖尾因子（T）（一）理论塔板数（n）

以被分析物主峰或规定的色谱峰计算柱效，以确定色谱峰的尖锐程度，尤其在痕量组分测定中尤为重要。

如测得n低于规定，应改变柱长或载体性能、重填色谱柱等以求达到。药物分析技术（二）分离度（R）分离度是评价相邻峰分离程度，或内标峰与主峰的分离程度，便于定量分析时确定测定结果的准确性。除另有规定外，R≥1.5药物分析技术（三）重复性（RSD）

1×5峰面积

3×3校正因子RSD≤2.0%药物分析技术（四）拖尾因子（T）拖尾因子T是评价色谱的对称性，便于保证峰积分时的测量精度，尤其采用峰高法计算含量时。除另有规定外，T应0.95~1.05药物分析技术非正常峰色谱峰——

T=0.95~1.05——T<0.95——T>1.05正常峰（对称）前沿峰拖尾峰

除另有规定外，峰高法定量时T

应在0.95～1.05之间。峰面积法测定时，T

值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。色谱分析法的含量测定色谱分析法的含量测定主要指的是色谱的定量分析

色谱分析的重要作用之一是对样品定量。色谱法定量的依据是：组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。在此，响应信号指峰面积或峰高。常用方法有：外标法、内标法、面积归一化法等。色谱的定量分析

按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高)，按下式计算含量:Cx为供试品溶液的浓度，ＣR为对照品溶液的浓度，Ax为供试品的峰面积，AR为对照品的峰面积。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。一、外标法（标准曲线法）(１)原料药百分含量的计算公式V为供试品溶液的体积，D为供试品稀释倍数，W为供试品的取样量。(２)片剂的含量测定计算为片均片重，S为标示量。当分析样品不能全部出峰时，可考虑用内标法定量。精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，各精密量取适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子:式中:AS为内标物质的峰面积，AR为对照品的峰面积，CS为内标物质的浓度，CR为对照品的浓度。

二、内标法

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量:式中:AX为供试品的峰面积，CX为供试品的浓度，A′S为内标物质的峰面积，C′S为内标物质的浓度，f为校正因子。采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量进样，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。要求所有组分必须有相应的色谱峰。用于杂质检查时，由于仪器响应的线性限制，峰面积归一化法一般不宜用于微量杂质的检査，只能粗略地定量。三、面积归一化法紫外可见分光光度法一、紫外-可见吸收光谱物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产生的分子吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。不同物质的分子结构不同，所产生紫外-可见光谱各有特点。

利用物质紫外-可见吸收光谱的特性与物质组分之间的关系建立起来的分析技术，称为紫外可见吸收光谱技术（Ultravioblet-VisibleAbsorptionSpectrometry，UV-VisUV-vis）。紫外-可见光谱技术特点

（1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。（2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。（3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。（4）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。（5）应用广泛，无机、有机物均可测定。紫外-可见分光光度法的基本原理二、透光率和吸光度定义：T取值为0.0%~100.0%T=0.0%：光全吸收T=100.0%：光全透过T=ItI0×100%tI0=It+Ia+Ir吸收光反射光透过光IaIr

T↑，溶液吸收度↓；T↓，溶液吸收度↑。即透光率T能够反映溶液对光吸收程度。1.透光率（透光度）T2.吸光度（吸收度）A定义：A=lg1T=-lgT=lgI0ItA=-lgT,T=10-A

透光率T能够反映溶液对光吸收程度，但通常用1/T反映吸光度。

三、光的吸收定律

朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度Ａ与溶液厚度Ｌ和其浓度Ｃ的定量关系：朗伯定律:A=k1×L比尔定律：A=k1×CA=kCL朗伯-比尔定律:L→2L时，A、T→？

2AA=-lgT,T=10-A=10-kcL吸光系数浓度液层厚度T2

朗伯-比尔定律：一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度A与其浓度C及液层厚度L的乘积成正比。适用范围：

①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。②均匀、无散射溶液、固体、气体。③吸光度A具有加和性。Aa+b+c=Aa+Ab+Ac四、吸光系数1、摩尔吸光系数或Em：

在一定λ下，c=1mol/L，L=1cm时的吸光度。

单位：L/(mol.cm)

2、百分吸光系数/比吸光系数:在一定λ下,c=1%(W/V)，L=1cm时的吸光度。