蛋白样本制备、定量及western步骤详解课件

蛋白样本制备与WesternBlot蛋白样本制备与WesternBlothttp://www.主要内容蛋白样本制备的目的1蛋白样本制备总体原则和策略2案例分析—细胞总蛋白的提取3成功的WesternBlot6蛋白提取产品选择指南4蛋白定量方法的选择5CompanyLogo主要内容蛋白样本制备的目的1蛋白样本制备总体原则和策略2案例2一蛋白样本制备成功蛋白分析的基础蛋白样本activityassaysproteinmicroarraysSDS/IEFimmunoblottingmassspectrometry2-DEEMSAELISA蛋白样本制备的目的:后续应用CompanyLogo一蛋白样本制备成功蛋白分析的基础蛋白样本activ3二蛋白样本制备的原则蛋白样本制备原则方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性；尽量抽提完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。CompanyLogo二蛋白样本制备的原则蛋白方法应具备标准化，具有重现性4二蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的活性分析免疫印迹杂交

免疫沉淀或共沉淀1D2DEMSACHIP等实验材料细胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四级结构特征磷酸化等修饰……方法的选择

1自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取2购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取CompanyLogo二蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的实验材料目的蛋白的5三案例分析--细胞中总蛋白的制备高速离心收集上清即得全蛋白样本细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟蛋白定量和SDS检测裂解样品离心收集定量检测CompanyLogo三案例分析--细胞中总蛋白的制备高速离心收集上清即得全6细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂缓冲液蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：H2O、NaCl、等还原剂RIPABufferCompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活7细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点

缓冲液Tris-HCl（pH7.5),提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点8细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活9各类表面活性剂特点

1阴离子型:SDS脱氧胆酸盐

2阳离子型:

CPB和CTAB3双性离子型:CHAPSZwittergent系列

4非离子型:Brij系列

Triton-100NonidetP40Tween系列等CompanyLogo各类表面活性剂特点1阴离子型:CompanyLogo10选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂选用表面活性剂考虑的因素工作条件下表面活性剂的溶解性使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类考虑表面活性剂的去除方法表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度尽量使用毒性较低的表面活性剂因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析CompanyLogo选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面11去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法HydrophobicAdsorption

2透析法Dialysis3凝胶层析法

GelChromatography4离子交换层析Ion-exchangeChromatography

根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除.

CompanyLogo去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法Hydrophobic12细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点蛋白抑13蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒CompanyLogo蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒CompanyLogo14细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点磷酸抑15磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。常规的抑制剂主要包括：

试剂名称抑制作用氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸

CompanyLogo磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷16细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基乙醇等。.CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点还原剂17细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点其它水；溶剂NaCl：CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点其它水18全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘油,稳定蛋白注意事项可以适量加入Benzonase/DNaseI等核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷酸酶使用的Detergent的种类纯度浓度干扰去除等因素Temperature试剂和器皿冰上预冷,低温4℃操作细胞或组织的样本量裂解液的用量CompanyLogo全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘油,稳定蛋白注意事项可以适19细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点Com20四蛋白样本制备产品选择指南CompanyLogo四蛋白样本制备产品选择指南CompanyLogo21核蛋白样本制备抽提原理低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;离心分离出胞核;高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子)

实验注意事项试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量细胞总量抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂CompanyLogo核蛋白样本制备抽提原理CompanyLogo22膜蛋白样本制备CompanyLogo膜蛋白样本制备CompanyLogo23膜蛋白的抽提方法及原理方法多直接抽提法分级抽提法

1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提

2:按溶解性分级抽提

3:按亚细胞分级抽提

产物细胞膜蛋白细胞器质膜蛋白注意事项根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.样本量CompanyLogo膜蛋白的抽提方法及原理CompanyLogo24膜蛋白的直接提取CompanyLogo膜蛋白的直接提取CompanyLogo25蛋白的分级提取按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。CompanyLogo蛋白的分级提取按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样26亚细胞分级抽提用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解CompanyLogo亚细胞分级抽提用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，27四种亚细胞组分分离提取的结果CompanyLogo四种亚细胞组分分离提取的结果CompanyLogo28线粒体蛋白样本制备首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体,胞质,胞核.再用线粒体抽提Buffer溶解线粒体蛋白.CompanyLogo线粒体蛋白样本制备首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体,胞29其它蛋白抽提产品高丰度蛋白去除试剂盒信号蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒CompanyLogo其它蛋白抽提产品高丰度蛋白去除试剂盒CompanyLogo30五蛋白定量产品选择指南CompanyLogo五蛋白定量产品选择指南CompanyLogo31BCA法蛋白定量BCA（bicinchoninicacid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。CompanyLogoBCA法蛋白定量BCA（bicinchoninic32Bradford法蛋白定量

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。

CompanyLogoBradford法蛋白定量考马斯亮兰G-250染料，在33Lowery法蛋白定量Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。CompanyLogoLowery法蛋白定量Lowry法蛋白质测定法是最灵34六成功的WesternBlotDiagram通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白

原理CompanyLogo六成功的WesternBlotDiagram通过电35六成功的WesternBlot二抗孵育蛋白提取与定量一抗孵育封闭转膜SDS-聚丙烯酰胺电泳蛋白变性显影CompanyLogo六成功的WesternBlot二抗孵育蛋白提取与定36蛋白变性Tris-cl(PH6.8)

SDS

GlycerolBromphend-blue

β-巯基乙醇

DTT高温变性,形成蛋白质-SDS胶束急速冷却，防止复性加入Samplebuffer沸水浴15min冰浴30minCompanyLogo蛋白变性高温变性,形成蛋急速冷却，防止复性加入沸水浴15mi37SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳产物：三维网状结构凝胶加速剂催化剂单体交联剂缓冲液Tris-Cl四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（Acr）过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（Bis）CompanyLogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳产物：三维网状结构凝胶加速剂催化剂38SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。CompanyLogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩39SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。CompanyLogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选40聚丙烯酰胺分离胶配方CompanyLogo聚丙烯酰胺分离胶配方CompanyLogo41SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制分离胶隔绝空气灌好后一般室温放置30－40分钟CompanyLogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制分离胶42SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方CompanyLogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方CompanyLogo43SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制积层胶插入梳子CompanyLogoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制积层胶44SDS胶制备注意事项过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置2－3天。配制30％丙烯酰胺储存液要过滤。配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。要根据温度调整TEMED的使用量。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。CompanyLogoSDS胶制备注意事项过硫酸铵一般现配现用，如连续实45上样及电泳提前将样品沸水浴5分钟，12000－14000rpm离心5分钟。根据自己的设计上样。80V恒压跑浓缩胶。看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.4－0.6mm时停止电泳。CompanyLogo上样及电泳提前将样品沸水浴5分钟，12000－14000rp46转膜

蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。CompanyLogo转膜蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接47转膜CompanyLogo转膜CompanyLogo48转膜注意事项PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡20分钟。膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。分子量（kd）转膜条件<20200mA恒流1小时20-100200mA恒流2小时100-200200mA恒流6小时或30V恒压过夜>200同上，可在转膜液中加0.1％SDSCompanyLogo转膜注意事项PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除49膜的封闭为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用5％的脱脂奶粉或者3％的BSA室温或37度封闭2小时。CompanyLogo膜的封闭为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结50转好蛋白的膜ProteinProteinCompanyLogo转好蛋白的膜ProteinProteinCompanyLo51封闭ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentCompanyLogo封闭ProteinProteinBlockingAgent52一抗孵育ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentPrimaryAntibodyCompanyLogo一抗孵育ProteinProteinBlockingAge53二抗孵育ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentEEPrimaryAntibodySecondaryAntibodyCompanyLogo二抗孵育ProteinProteinBlockingAge54显影ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentEEPrimaryAntibodySecondaryAntibody－Enzyme(E)sssssPPPPSubstrateCompanyLogo显影ProteinProteinBlockingAgent55显色方法HRP酶促底物直接显色CompanyLogo显色方法HRP酶促底物直接显色CompanyLog56显色方法—化学发光

SuperSignal®WestPico化学发光底物SuperSignal®WestFemto超灵敏型底物SuperSignal®WestFemto增强型底物主要优点与ECL™系统相比减半的价格、双倍的信号适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物延长的信号持续时间使这种底物用于今天的成像设备最为理想检测下限10-12g10-15g10-14g信号持续时间6-8小时8小时24小时首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片建议一抗稀释度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建议二抗稀释度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000产品保存期室温1年4℃1年或室温6个月室温1年建议印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDFCompanyLogo显色方法—化学发光SuperSignal®WestPi57成功的要素质优量足的蛋白样本科学的对照正确的抗体选择保存和使用细致的实验操作步步监测CompanyLogo成功的要素质优量足的蛋白样本CompanyLogo58科学的对照蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率

阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性

二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果CompanyLogo科学的对照蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用59蛋白MarkerCompanyLogo蛋白MarkerCompanyLogo60WB常用内参及其技术参数antibody[AC-15](ab6276)at1/5000dilution,Lysates/proteinsat20ugperlane

Lane1:HeLanuclear

Lane2:HeLawholecelllysate

Lane3:A431celllysate

Lane4:Jurkatcelllysate

Lane5:HEK293celllysate.CompanyLogoWB常用内参及其技术参数antibody[AC-15](61正确的抗体选择保存和使用一抗的选择:

1、样本的种属

2、适用于WB实验方法

3、单克隆抗体经亲和纯化的多克隆抗体二抗的选择与一抗种属匹配

HRP标记的

重链＋轻链全长的、Fab段的以及Fc段的抗体的保存和使用：

1、按说明书的要求分装保存；避免反复冻融

2、工作液现配