广西三七灰霉病流行规律研究

广西三七灰霉病流行规律研究

中药三七[公车]f.h.chen]，被称为田七，是五加科人参科三七的干燥生根。它主要产于云南和广东，被称为“南人参之王”。它具有散瘀、止血、消肿、镇痛等功效，被经典方剂《本草纲目》、《谚语》和其他经典文献收录。灰霉病是一种普遍的世界性病害,在蔬菜、水果、花卉等作物上普遍发生,对此相关学者已开展了深入的研究目前防治灰霉病菌主要以化学防治为主,辅以生物防治和农业防治1材料和方法1.1病原菌的分离、培养和分级供试典型三七灰霉病病叶及健康三七植株均取自广西靖西禄峒三七种植地,将三七植株盆栽于实验室待用。供试药剂:50%多菌灵可湿性粉剂(四川国光农化有限公司);70%甲基托布津可湿性粉剂(日本曹达株式会社);50%腐霉利可湿性粉剂(霍州市绿洲农药有限公司);50%异菌脲悬浮剂[拜耳作物科学(中国)有限公司];40%嘧霉胺悬浮剂[拜耳作物科学(中国)有限公司];25%咯菌腈悬浮剂(瑞士先正达作物保护有限公司);50%嘧菌环胺水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司);75%百菌清可湿性粉剂(江苏省天星农化公司);50%福美双可湿性粉(河北赞峰农化有限公司);80%代森锰锌可湿性粉剂(利民化工有限公司);25%嘧菌酯悬浮液(瑞士先正达作物保护有限公司);40%氟硅唑乳油(标正作物科学有限公司);30%戊唑醇可湿性粉剂(常州沃富斯化工有限公司);45%敌磺钠可湿性粉剂(丹东市农药总厂);15%咪鲜胺乳油(海南博士威)。田间观察、记录病害发生初期、中期、后期的症状,并将典型灰霉病叶采回实验室,采用常规的组织分离法对病原菌进行分离、纯化,并根据柯赫氏法则将分离到的真菌进行回接再分离试验,确定致病菌,观察病原菌菌落、菌丝、孢子的形态特征,初步鉴定病原菌种类采用SDS法提取病原菌菌株的基因组DNA具体研究方法参考袁高庆等待上述病原菌培养7d后,在每个培养皿中加入10mL灭菌水,过滤菌丝后用纽鲍尔(Neubauer)血球计数板统计孢子量,每处理3个重复。待上述病原菌培养14d后,加1%葡萄糖溶液于大量产孢的菌落上将孢子洗下,配置成孢子悬浮液(10×10倍显微镜下每视野约50~80个孢子),滴于凹玻片上,并分别放置于上述8个试验温度下培养,48h后观察、统计100个孢子的萌发率,每处理重复3次。生长速率(mm/d)=[处理后菌落直径(mm)-5mm]/生长时间(d)(2)孢子萌发对湿度的要求。用不同浓度的硫酸将干燥器分别调制成相对湿度为100%+水滴、100%、90%、80%、70%、60%、50%,共7个处理;用胶头滴管取一滴1.2.2-(1)中配置的孢子悬浮液(10×10倍显微镜下每视野约50~80个孢子)于洁净的载玻片上并均匀涂布,快速风干后分别放置于上述不同相对湿度的干燥器中,以20℃恒温培养,48h后观察孢子萌发率,每处理重复3次。(2)不同保湿时间对三七灰霉病病程的影响。于2015年3月25日将培养好的三七灰霉病病原孢子悬浮液(同上)喷雾接种至健康的2年生三七叶片上,并分别用塑料袋保湿8、12、24、36、48h,以接种后不保湿为对照(CK),每个处理5株;每天观察发病情况,记录发病日期,比较不同保湿时间与病程的关系。(3)田间病斑显症率。于2015年3月25日将三七灰霉病病原孢子悬浮液喷雾接种至健康的2年生三七叶片;在三七灰霉病典型病斑出现后,选取10张叶片,每天记载叶片上的病斑总数,直到病斑总数不再增加为止;计算逐日显症率、累计显症率。逐日显症率=每天病斑增长数/最后病斑总数×100%(1)三七灰霉病分级标准。在对三七灰霉病病叶观测的基础上,并参考人参等同科属植物灰霉病的分级标准,将该病害的发生程度分为0~5个级别0级,叶片无病斑;1级,有少量针眼大小的黄色小斑,病斑面积占叶片面积的5%以下;2级,形成中等数量不规则灰褐色水渍状病斑,病斑面积占叶片面积的5%~10%以下;3级,病斑扩大呈透明至灰褐色,水渍状软腐状,占叶片面积的10%~20%以下;4级,病斑透明至灰褐色,少数聚集成块,病斑面积占叶片面积的20%~50%;5级,病斑灰褐色,多数联成大斑块,病斑面积占叶片面积的50%以上。(2)不同立地条件、不同生长年限三七灰霉病发生规律。2015年3月~12月份上旬三七生长季节,在靖西县的禄垌、武平、新靖3地,在海拔及种植密度一致的条件下,调查旱地(农田改造)、坡地(坡度约为15~200的杉木林改造)、林下(八角+杉木的混交林)3种立地条件下病害发生情况;并在立地条件一致的七园,调查不同生长年限三七(1年生、2年生、3年生)灰霉病的发生情况。具体做法是,2015年3月~12月份上旬每个月的10日分别在上述不同类型七园内五点取样,每点调查10株三七所有叶片灰霉病发生情况,根据上述分级标准,观察、统计发生级别,计算病情指数;并根据靖西县气象局提供的数据,分析气象因素与病害发生的关系。病情指数=∑(各级病级代表值×该级病叶数)/(调查总叶片数×发病最重级代表值)×100采用菌丝生长速率测定法菌落扩展直径(mm)=菌落的平均扩展直径(mm)-5菌饼直径(mm)2结果与分析2.1田间病害症状及安全性分析该病害早期主要为害三七叶片,多始于叶尖,病斑最初为淡黄色针眼大小斑点,2~3d后发展为淡褐色不规则水浸状病斑,后呈“V”形向内扩展。为害中期,受害叶主脉褪绿黄化,感病部位的叶绿素亦退去,呈水渍透明状软腐披垂(图1-a)。随着为害的加重,病叶随之不断向内软腐缩缢,发病整齐的田块,叶片似被剪刀统一剪掉了1/3,容易脱落。发展至末期,整张叶片变成黑褐色,呈线条状脱落。发病期间如遇到连续阴雨天气,或田间湿度过大时,病斑上布满灰色霉状物,触及便会呈现烟雾状分散。三七的叶柄、茎杆亦受害,主要表现为黑褐色病斑且缢缩。9~11月份为三七花果期,此时气候条件适宜灰霉病的发生,三七花序易受害,病部通常先呈水浸状再逐渐变为灰黑色、扭曲,并使花轴容易脱落,受害果实先表现出淡黄色斑点,后期扩大成黑褐色病斑,湿度大也时常会出现灰黑色霉层。经分离、纯化、回接、再分离,得致病菌株H-1,该病原菌在PDA上生长良好,菌落致密,灰色、絮状,菌丝茂盛但较短,产孢后菌落表面呈粉状(图1-b)。分生孢子梗细长、直立、淡褐色,大小为(70.00~180.00)μm×(5.8~14.5)μm,有1~2次分枝,顶端膨大成球形,上面有许多小梗,分生孢子聚生成葡萄穗状;分生孢子呈卵圆形或椭圆形,无色至灰色,单胞,大小为(6.0~11.5)μm×(6.2~12.0)μm(图1-c)。结合病害症状、病原形态,参考有关资料,初步将其鉴定为灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.exFr.)。采用通用引物ITS1/ITS4对H-1菌株的rDNA-ITS序列进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,得到1个大小约为500bp的片段,经序列测定,确定该片段全长451bp(图2);将测序结果在GenBank中进行同源性分析可知,该病原菌株与(Botrytiscinerea)同源性达99%,结合形态鉴定结果确定该病原菌为灰葡萄孢菌(B.cinerea)2.2细菌的生物学特性2.2.1产孢温度对芽孢杆菌生长的影响表1数据表明,三七灰霉病菌丝在5~28℃均可生长,适宜温度为15~25℃,最适温度为20℃;5~28℃温度范围内均可产生孢子,适宜产孢温度为15~20℃,最适产孢温度为20℃;5~20℃温度范围内孢子均可萌发,适宜的萌发温度为20~25℃,最适萌发温度为20℃。从研究结果来看,该菌株喜温凉的环境,气温20℃左右利于菌丝生长、孢子的形成及萌发。2.2.2不同湿度对蘑菇萌发的影响2.3病史及黄斑的显著性率2.3.1不同季节广西西部山区对4-11月不同病害的观察与表现从表3数据来看,灰霉病菌在广西不同季节、不同生长年限三七的病程为5~13d不等,但有一定的规律。首先相同种植年限的三七,10-11月份的病程短于其他调查月份,主要是因为此季节广西西部山区气温冷凉,且时有降雨,适宜孢子的萌发侵染,故从孢子侵染到田间症状的表现所需时间较短。其次在相同季节,1年生三七的病程要短于2年生和3年生,2年生、3年生三七的病程基本相同,原因可能是幼龄的三七叶片对灰霉病菌的抵抗能力稍差,在温湿度一致的情况下,病原菌从接触、侵入到症状表现的过程较快。2.3.2保湿时间的确定结果显示(表4),在试验时间2015年3月25日,正常情况下接种灰霉病菌到2年生三七,病程为10d(CK);接种后保湿8~12h,病程为8d;保湿24~36h,病程为6d;保湿48h,病程为4d。上述结果表明,接种后保湿时间越长,病程越短。分析原因是高湿度利于病原菌孢子的萌发侵染,这与2.2.2所述的结论一致,即该病原菌孢子的萌发需要较高的湿度条件。2.3.3基质疾病的发病率2.4基于立地条件和生长年限的灰霉病病害发生情况从三七灰霉病季节发展曲线来看(图3),3月~5月份各调查点病害病情指数为上升趋势。3月份时,旱地、坡地、林下灰霉病的病情指数分别为18.4、13.5、8.5,5月份病情指数分别升至20.1、15.1、10.3;从曲线走势来看,6月~8月份病情指数值均较低,处于曲线谷底部分,为全年田间发病较轻的季节;9月份,病情指数开始缓慢升高;10~11月份,病情指数较其他月份都要高,特别是11月份处于曲线峰面水平,为全年发生较严重的季节;12月份随着气温的走低,且三七进入倒苗休眠期,病情指数呈下降趋势。针对病害周年发生情况,结合靖西县气象局提供的数据进行比较分析。结果显示,靖西县近3年(2013~2015年)9~12月份平均气温分别为24~27℃、20~25℃、16~20℃、10~15℃,气温冷凉,适宜灰霉病的发生,特别是10~11月份,平均气温16~25℃是灰霉病病菌最适宜的生长温度,而且此时降水量为91~46mm,远远高于1~4月份26~48mm的降水量,温度、降水均适宜灰霉病的发生,所以10~11月份为广西灰霉病发病高峰期。2014年11月,广西靖西化垌三七灰霉病大爆发,经查看可知2014年该地区气温偏低(15~17℃),且连续14d阴雨绵绵,所以在灰霉病易发期,要特别关注降雨情况,做好预防工作。从图3、4、5还可知,三七灰霉病的发生与立地条件、生长年限有一定的联系。各调查点海拔基本一致,立地条件不同,病害发生程度有差异,旱地七园灰霉病的病情指数变化曲线在坡地和林下之上,即病害严重度要大于坡地和林下,而林下种植的三七病情指数曲线在三者中处于最低水平,即病害发生相对要轻,整体上表现为旱地>坡地>林下(图3)。此外,同一调查点的三七园,七园边缘的发病程度要轻于园内(图4),原因主要是在发病期七农通常会掀开四周的帷帐,边缘四周的通气性要好,所以病害发生程度稍轻。图5表明,生长年限越大的七园病害发生越严重,3年生>2年生>1年生,除了老园子存在病原积累的问题外,经实地调查,认为原因主要是随着植株生长年限的增加,枝条及叶片量增加,田间叶片茂密,通透性差,从而利于病害的传播流行。而林下三七病害的发生要轻于旱地和坡地,一部分原因就是林下三七四周无帷帐圈盖,通透性好。可见,通风透气对于灰霉病的发生有一定的控制作用。2.5防治灰霉病的主要药剂各供试药剂对病原菌丝的生长抑制效果如表6所示。甲基托布津、多菌灵、腐霉利、异菌脲为早中期防治灰霉病的主打药剂,从表中数据看,腐霉利药后7d的抑制率为97.50%、药后14d为96.31%,表现出较好的抑制作用,而其他3种药剂的抑制率较低,约为50.00%~80.00%。咯菌腈、嘧菌环胺、嘧霉胺是近期用于防治灰霉病的3种主要药剂,对广西三七灰霉病菌丝生长具有较好的抑制效果,但有一定的差异,其中咯菌腈悬浮剂、嘧菌环胺对菌丝的生长抑制率达100.00%;嘧霉胺的抑制效果有所偏低,药后7d,抑制率为82.50%,14d后,抑制率为92.11%。福美双、代森锰锌、百菌清是广西七农常用来防治三七灰霉病的药剂,从表中试验数据来看,福美双药后14d抑制率为89.47%,有一定的抑制作用,而代森锰锌、百菌清的抑制作用不佳。嘧菌酯、氟硅唑对三七灰霉病表现出强的抑制作用且持效久,药后7、14d抑制率均为100.00%。综上试验数据表明,在不同时期用于防治灰霉病的7种供试药剂中,除了咯菌腈、嘧菌环胺仍具有较强的抑制作用外,三七灰霉病株对其他5种药剂都产生了不同程度的抗药性,特别是对多菌灵、甲基在托布津表现出较强的抗药性,药后14d室内抑制率仅为56.84%和73.16%。考虑到灰葡萄孢菌易产生抗药性的特点,建议将咯菌腈、嘧菌环胺与嘧菌酯、氟硅唑等4种室内抑制率达100.00%的药剂轮换使用。3立地条件对病害的影响经形态鉴定并结合分子生物学技术可知,广西三七灰霉病病原菌为灰葡萄孢菌(B.cinereaPers.exFr.),与已有的报道结果一致三七灰霉病的发生除了与外界温湿度有密切相关性外,与立地条件及三七种植年限也有一定的联系,旱地的发病程度要高于坡地和林下。旱地种植通常以遮阴网密封四周,除了通透性的原因外,还有就是靖西多地传统种植烟草和蔬菜,烟草灰霉病和番茄灰霉病历来就是2种严重的病害,本课题组将烟草及番茄灰霉病病株接种至健康三七上,都能成功侵染。笔者在调查中也发现,如果前茬或邻作物为烟草、番茄、蔬菜等,三七灰霉病的发生则会更严重;而坡地和林下种植能大大减少病原的这一来源,所以发病相