微生物发酵制药技术基础-发酵生产染菌及其防治

项目七发酵生产染菌及其防治单元二微生物发酵制药技术基础任务二杂菌污染的途径和防治杂菌污染的途径和防治种子带菌空气带菌操作失误设备渗漏或死角（一）种子带菌及其防治种子带菌原因：斜面菌种染菌培养基和器具灭菌不彻底种子转移接种过程染菌

种子培养设备装置污菌等。种子带菌的防治方法：（1）严格控制无菌室的污染，交替使用多种方法对无菌室灭菌。（2）制备种子时对砂土管、斜面、三解瓶及摇瓶均要严格管理，防止杂菌进入。（3）对每一级种子严格进行无菌检查，确保任何一级种子未受杂菌感染。（4）培养基及用具灭菌要彻底，高压灭菌时要完全排净冷空气应防止假压,达到不到所需的温度(二)空气带菌及其防治空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。过滤器灭菌时过滤介质被冲翻而造成短路，过滤介质烤焦或着火等；过滤介质装填不均匀使空气走短路；突然停止进空气时，发酵液倒流入空气过滤器；空气冷却器漏水，导致冷却水进入空气系统等。（三）培养基和设备灭菌不彻底原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；措施：可升温前搅拌和加淀粉酶。麸皮、黄豆饼等固形物溅到罐内各种支架上，堆积不易彻底灭菌。措施：预先配料实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。1.灭菌时，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”，导致灭菌不彻底而染菌。2.灭菌中产生泡沫，严重时可升至罐项，泡沫内带菌，温度低于灭菌温度，导致存活。

3.连续灭菌时，温度和时间要符合要求。蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。4.用于连续测定并控制发酵液pH值的复合玻璃电极、测定溶氧浓度的探头等，一般常采用化学试剂浸泡常会灭菌不彻底。（四）操作失误导致染菌5.发酵过程中操作不当如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；未及时添加消泡剂导致泡沫顶盖而染菌；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。（五）设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治设备渗漏：指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等形成微小漏孔后发生渗漏染菌。“死角”：由于操作、设备结构、安装及其他人为因素，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位。如盘管、空气分布管、发酵罐部件、管件等。空气分布管一般安装于靠近搅拌桨叶的部位，受搅拌与通气的影响很大，易磨蚀穿孔造成“死角”。避免措施：频繁更换空气分布管或认真洗涤等发酵罐的“死角”罐内的部件如挡板、扶梯、搅拌轴、拉杆、联轴器、冷却管等及其支撑件、温度计套管焊接处等的周围容易积集污垢，形成“死角”而染菌。避免措施：罐内壁涂刷防腐涂料、加强清洗并定期铲除污垢等。发酵罐的“死角”发酵罐的制作不良，不锈钢衬里破裂造成死角。避免措施：全部采用不锈钢或复合钢制作发酵罐发酵罐的“死角”发酵罐封头上的人孔、排气管接口、照明灯口、视镜口、进料管口、压力表接口等也是造成“死角”的潜在因素。避免措施：安装边阀，并注意清洗。发酵罐的“死角”发酵罐底部固形物堆积。避免措施：加强罐体清洗、适当降低搅拌桨位置。发酵罐的“死角”罐底的加强板长期受压缩空气顶吹而腐蚀、受损或裂缝，或焊接不当，造成灭菌不彻底。避免措施：煅成与罐底相同弧度，使之吻合紧密，并注意焊接质量。管路的安装或管路的配置不合理易形成“死角”

若干只发酵罐的排气管汇集在一条总的排气管上，在使用中会产生相互干扰，一只罐染菌往往，造成其他发酵罐的连锁染菌。避免措施：采用单独的排气、排水和排污管可有效防止染菌的发生。发酵过程的管路大多数是以法兰连接，但常会发生诸如垫圈大小不配套、安装未对中、法兰与管子的焊接不好、受热不均匀使法兰翘曲以及密封面不平等现象，从而形成“死角”。避免措施：各衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片的内径与法兰内径恰好相等，安装时对准中心，尽可能减少或取消法兰连接种子罐底部的移种管安装不当，就会存在蒸汽不易通达的“死角”。消除方法见图b。压力表安装不合理会形成“死角”。消除方法是在近压力表处安装放汽边阀。压力表安装不合理形成“死角”1，6-发酵罐；2-缓冲管；3，4-压力表；5-旋塞项目七发酵生产染菌及其防治单元二微生物发酵制药技术基础任务三发酵染菌原因分析总结发酵染菌的经验教训，积极采取必要的措施，防止生产过程中再次染菌，把发酵染菌控制在生产前。防患于未然是发酵生产过程中控制染菌污染的最重要措施。分析目的染菌原因分析可从以下三方面进行分析污染的杂菌种类染菌的规模污染的不同时间1.染菌的杂菌种类分析杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，除菌不彻底、设备渗漏，操作问题等）杂菌是真菌（可能是设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当）杂菌的种类染菌原因分析耐热的芽孢杆菌球菌、无芽孢杆菌等不耐热菌浅绿色菌落的杂菌霉菌酵母菌培养基或设备灭菌不彻底种子带菌/空气除菌不彻底设备或冷却盘管的渗漏无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当糖液灭菌不彻底或糖液放置时间过长根据染上杂菌的种类可以初步判断染菌原因2.染菌的规模分析大批量发酵罐染菌：种子、空气；前期：种子带菌，灭菌问题；中后期：空气带菌；部分发酵罐染菌：前期（种子染菌、连消系统灭菌不彻底）；后期（可能是中间补料染菌）个别发酵罐连续染菌：大都是由于设备渗漏3.不同染菌时间分析种子培养阶段：种子、灭菌、接种操作或设备因素；发酵前期：种子、灭菌、接种操作、空气带菌等；发酵后期：空气、补料、设备渗漏、泡沫顶盖、操作问题项目七发酵生产染菌及其防治单元二微生物发酵制药技术基础任务五噬菌体污染及其防治案例分析案例在谷氨酸发酵生产中，时常发生以下情况：发酵开始时，菌体生长良好，后来突然急剧减少，短短几小时内，数十吨发酵液中的菌体全部被破坏，不再积累谷氨酸，往往相继出现染菌，造成倒罐。

分析这是由于谷氨酸生产菌被一种微小的病毒—噬菌体侵染所致。噬菌体对谷氨酸发酵的危害，轻则减少，重则会引起发酵液全部倒弃，造成严重损失。

利用细菌或放线菌进行的发酵生产容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大威胁。

噬菌体可以通过环境污染、设备的渗漏或“死角”、空气系统、培养基灭菌过程、补料过程及操作过程等环节进入发酵系统。

(一）噬菌体污染的主要症状与检查方法1.噬菌体污染的主要症状（1）发酵液光密度上升缓慢，甚下降，肉眼可见发酵逐渐变清；（2）耗糖速率减慢或停止，发酵液中残糖高；（3）pH值逐渐上升，可达8.0以上，不再下降；（4）CO2排出量异常，发酵周期延长；（5）产生大量泡沫，发酵液粘度大，甚至出现黏胶状，发酵液发红、发灰；（6）代谢产物产量少，增长缓慢，甚至停止；（7）显微镜观察，菌体数量减少，革兰氏染色呈红色碎片；（8）平板检查有噬菌斑，摇瓶检查发酵液清稀；（9）提取时难中和，分离困难，收率低。2.噬菌体污染的检查方法

双层平板法单层平板法平板交叉划线法载玻片快速法液体培养检查法（1）双层平板法先在培养皿中倒入底层固体培养基，冷却凝固备用。上层培养基灭菌后冷却至45℃左右，采用无噬菌体的一级种子液作为指示菌液。无菌吸管吸取0.5ml待检样品与0.5ml指示菌液混合，倒入45℃左右的上层培养基中，混匀后倒入上层平板中。32℃恒温培养20h，观察有无噬菌斑。噬菌斑:概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。)应用:

噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。噬菌斑形成的过程和原理是：噬菌体侵染敏感细胞后，释放子代噬菌体，通过培养基扩散到四周细胞，继续侵染，引起连锁细胞裂解，从而形成形态和大小不同的空斑。（2）单层平板法培养基灭菌后冷却至45℃左右备用。用无菌的0.1%蛋白胨液将待检液稀释至10-5～10-6。无菌操作下吸取1ml稀释样品、0.5ml指示菌液，加入培养皿内，倒入冷却至45℃左右的培养基，摇匀。32℃恒温培养20h，观察有无噬菌斑。（3）平板交叉划线法取培养皿按常规倒入培养基，制成平板，然后取指示菌液划线，再取待检液与其交叉划线。32℃恒温培养10～12h左右。当噬菌体较少时能发现噬菌斑，如果噬菌体较多，则发现交叉处透明，同时可见到由含噬菌体的交叉点向指示菌液线析展的一条亮线（噬菌带）。此法既可检查噬菌体，又可检查杂菌污染。（4）载玻片快速法噬菌体待检液0.1ml和菌悬液0.1ml与含有0.5%～0.8%琼脂的培养基2ml混合，在无菌载玻片上凝固，培养2.5～4h，再在显微镜下观察有无空斑，则可知有无噬菌体。（5）液体培养检查法种子培养基20ml，灭菌后接入新鲜种子0.5ml及待检液0.5ml，震荡培养4h，观察液体浑浊度，如OD值正常，且镜检无杂菌，说明正常；如培养液变清，说明有噬菌体感染。

（二）噬菌体感染的途径与防治措施1.噬菌体感染的途径生产中，有寄主细胞存在的地方，一般都存有它们的噬菌体，发酵车间、提取车间及其周围更有机会积累噬菌体。如果不注意把活菌体排放到环境中去，使生产环境中的噬菌体有了寄主而不断增殖，造成噬菌体密度增高而形成污染源。

（二）噬菌体感染的途径与防治措施2.噬菌体防治的措施严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌；严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内；抑制罐内噬菌体的生长。3.发酵感染噬菌体的处理方法并罐法轮换使用菌种或使用抗性菌株放罐重消法罐内灭噬菌体法项目七发酵生产染菌及其防治单元二微生物发酵制药技术基础任务一染菌对发酵的影响1、什么叫发酵染菌?在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。

2、造成发酵染菌的可能途径有哪些？种子带菌空气除菌不净操作失误设备渗漏或死角染菌仍是发酵工业的致命伤。轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量；严重者造成生产失败，浪费大量原材料，造成严重经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别是又找不到染菌原因，未有防治措施时，往往会影响人们的情绪和生产积极性，造成无法估量的危害。3、染菌会对发酵工业造成哪些不良影响？目前要做的是要提高生产技术水平，强化生产过程的管理，把握好各个易染菌的环节，尽可能防止发酵染菌的发生；而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。5、既然染菌不可避免，哪我们应该怎样做？4、在现有科学条件下能否做到彻底不染菌？据报道，国外抗生素发酵平均染菌率为2%-5%，国内的抗生素发酵、青霉素发酵染菌率2%，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5%，谷氨酸发酵噬菌体感染率1-2%。（一）染菌对不同发酵过程的影响各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。青霉素发酵染菌：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，容易受到杂菌的污染，严重抑制生产菌的生长和代谢产物的生成。噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁非常大1.种子培养期染菌种子培养期微生物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。（二）染菌发生的不同时间对发酵的影响2.发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。3.发酵中期染菌发酵中期的菌体量大，营养成分已大量消耗，并已形成一定的产物。如果发酵中期染菌，营养物质会被迅速消耗，而代谢产物的积累迅速减少或停止，甚至已