微生物发酵制药技术基础-种子扩大培养技术

项目四种子扩大培养技术单元二微生物发酵制药技术基础任务二生产车间种子培养生产车间种子制备是将实验室制备的孢子悬浮液或摇瓶种子接入种子罐，通过控制工艺条件，将菌种培养成为大量菌丝体的过程。种子罐培养的目的是要大量培养有活力的、无杂菌的种子，即扩大培养。1.培养基选择的原则培养基应选用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。培养基还要考虑对种子进行驯化，为了驯化种子适应发酵罐环境，种子罐中的培养基应逐渐接近发酵罐中的培养基配方和培养条件。摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间的移种：2.接种方法：可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。主要采用压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零。摇瓶培养种子—火焰封口接种—种子罐培养种子火焰封口接种3.种子罐级数的确定种子罐级数指制备种子时需扩大培养的次数.种子制备的工艺过程中，因菌种不同，一般可以分为一级种子、二级种子和三级种子。种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌体生长速度、产物品种、生产规模及发酵设备的合理利用率。

一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵。。。。。。。依次类推可知发酵的级数=种子级数+1种子罐级数的影响：种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜过少。

种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件有关。

优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可减少种子罐的级数。1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。

例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32℃培养7-10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。例如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐（发芽罐）于27℃培养40h，孢子发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），27℃培养10-24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。

3.生长更慢的菌种

链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐(5—30L)进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。项目四种子扩大培养技术单元二微生物发酵制药技术基础任务三影响种子质量的因素及控制（一）影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间1.培养基生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。起主要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+

、Cu2+

、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。2.培养条件（温度和湿度）温度和湿度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。例如：龟裂链霉菌斜面温度：36.5-37℃

湿度：40-50%相对湿度（%）斜面外观活孢子计数（亿/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄、下部稠略黄上部薄、中部均匀发白一片白，孢子丰富，稍皱1.22.35.73.培养时间和冷藏时间培养时间

孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟的阶段终止培养。冷藏时间

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6˚C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。4.接种量接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。（二）影响种子质量的因素及控制培养基培养条件种龄接种量1.培养基营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要尽可能与发酵培养基相近。温度过低，菌种生长发育缓慢温度过高会使菌丝过早自溶在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。

2.培养条件（1）温度（2）通气与搅拌

足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗丝状微生物不宜剧烈搅拌3.种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

过老：生产能力下降，菌体自溶。过嫩：发酵前期生长缓慢，发酵周期延长原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。

4.接种量接种量指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。较大的接种量——可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。接种量过大——会引起溶氧不足，影响产物合成；接种量过小——会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。增大接种量方法：1、双种法：两只种子罐，一只发酵罐如卡那霉素：双种比单种的发酵单位提高8%，到达产量高峰的时间提前。2、倒种法：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。如链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。项目四种子扩大培养技术单元二微生物发酵制药技术基础任务四种子质量标准（一）细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞菌体：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛。（二）生化指标种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。（三）产物生成量种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。（四）酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。（二）生化指标种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。（三）产物生成量种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。（四）酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。项目四种子扩大培养技术单元二微生物发酵制药技术基础任务一实验室种子制备

种子质量的优劣对发酵生产起关键作用。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。种子液(几或几十立方米)按10%接种量发酵罐(几十或几百立方米)由实验室制备到车间生产的过程

种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。菌种扩大培养的目的：为发酵提供足够数量的代谢旺盛的种子（纯种培养物）。优良种子应具备的条件菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段斜面砂土管冷干管液氮管

二级斜面一级斜面

米孢子

母瓶

子瓶

一级种子罐

发酵罐

二级种子罐

三级种子罐种子扩大培养过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。（一）菌种活化茄瓶斜面种子的活化：将保藏在沙土管或冻干管中的菌种经无菌操作接入适合孢子发芽或营养体生长的斜面培养基上进行培养的过程。目的是使保藏的菌种达到正常稳定的生长代谢速度。斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据菌种特性的不同可采用不同的培养方法。

可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。1.产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种（二）菌种活化后的培养母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落②接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月孢子培养（1）霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养温度一般为25-28℃时间一般为4-14d。麦麸培养基原始菌种斜面试管250ml茄子瓶固体培养基培养（大米或小米）成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。例如：产黄青霉菌25~28℃，4~14天（2）放线菌孢子制备一般采用斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、蛋白胨和一些无机盐等，C、N不要太丰富（碳源约1%，氮源不超过0.5%）。培养温度：大多数为28˚C，少数37˚C

。培养时间：5～14天。可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，获得菌丝体，作为种子。例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。2.产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种液体接种（斜面——三角瓶）贴标签；点酒精灯；握斜面；旋松棉塞；烧灼接种环；拨棉塞；试管口过火；取菌；接种；试管口过火；盖棉塞；烧灼接种环摇瓶种子制备过程注意事项培养基营养成分含量应比斜面丰富；能保持生长过程中pH稳定；培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50ml/250ml瓶；注意摇床转速，转速越快，通气越好。保藏的菌种试管斜面培养基（32℃，18~24小时）