抗生素的发酵生产-链霉素的发酵生产

单元三抗生素类药物的发酵生产项目四链霉素的发酵生产

任务二链霉素的发酵生产（一）种子制备1.斜面孢子培养碳源：葡萄糖氮源：蛋白胨，豌豆浸汁等原始斜面质量要求：菌落分布均匀，密度适中，颜色洁白，单菌落丰满由原始斜面的丰满单菌落接种至子斜面上，长成后即得生产斜面，应为白色丰满的梅花型或馒头型，背面为淡棕色色素，排除各种杂型菌落。（二）种子制备2.摇瓶种子培养生产斜面的菌落接种到摇瓶培养基中，经过培养即得摇瓶种子。摇瓶种子（母瓶）可以直接接种子罐，也可以先扩大培养，用培养所得的子瓶接种。摇瓶培养基的成分为黄豆饼粉，葡萄糖，硫酸铵，碳酸钙等种子质量检查指标：菌丝阶段特征，发酵单位，菌丝粘度或浓度，糖氮代谢，种子液色泽和无杂菌检查。2.种子罐扩大培养种子罐培养为2～3级，接种量一般都为10％，在种子培养过程中必须严格控制好罐温、通气搅拌和泡沫控制，以保证菌丝生长良好，得到合格的种子。（三）发酵工艺控制1.链霉素的发酵培养基

葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐和碳酸钙等（链霉素的发酵需要在高的氧传递水平和适当的低无机磷酸盐浓度下进行）其中葡萄糖是链霉素发酵的最适碳源，一般葡萄糖的用量在2%～14%之间，但在孢子基础培养基时，以5%～8%为好，补料后，总量在10％以上。也可使用葡萄糖结晶母液和工业葡萄糖代替结晶葡萄糖。链霉素发酵使用的氮源，有机氮源包括黄豆饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、酵母粉和麸质水，其中以黄豆饼粉为最佳，其他可作为辅助氮源。无机氮源以硫酸铵和尿素为最常用，采用有机氮源时，必须注意其品种、来源、质量等无机元素中的磷颇为重要，在工业生产中，一般采用葡萄糖为碳源，配以较低浓度的磷酸盐来配备培养基。CaCO3可以调节发酵液中的pH值和中和灰色链霉素代谢过程中产生的有机酸。需注意的是Fe2+浓度超过60μg/ml以上就产生毒性，显著影响链霉素的产量，而对菌丝体生长影响较小，2.链霉素发酵条件及中间控制要点溶氧的影响及控制温度的影响及控制pH值的影响及控制中间补料控制溶氧是灰色链霉菌高度需氧菌，临界溶氧浓度约为10-5mol/L，溶氧在此值以上，细胞的摄氧率达到最大限度，也能保证有较高的发酵单位。温度：灰色链霉菌对温度敏感，发酵温度以28.5℃左右为宜pH控制在6.0-7.5之间中间补料为延长发酵周期，提高产量，链霉素发酵采用中间补碳、氮源补料量按补入后，糖含量为5%计算，但放罐时残糖浓度最好低于1%，以有利于后续的提取精制。补硫酸铵和氨水的控制指标，是以培养基的pH值和氨基氮的含量高低为准。pH值在7.5以下时，加入氨水发酵中、后期，发酵液的pH值如果高于7.2，补入0.1%的硫酸铵溶液，加入量以残氮浓度为0.7mg/ml左右。单元三抗生素类药物的发酵生产项目四链霉素的发酵生产

任务三链霉素的提取和精制发酵液预处理及过滤吸附洗脱精制干燥成品1.发酵液的预处理及过滤用草酸酸化至pH=3左右，直接蒸汽加热，维持2min，冷却，过滤，再用NaOH调pH值至6.7-7.2，得原滤液质量标准外观澄明pH=6.7-7.2温度在10℃以下高价离子含量很少链霉素浓度为5000U/mL2.吸附和解吸目前生产上都用羧酸树脂的钠型来提取链霉素。其交换吸附和洗脱的反应可用下列方程式表示：生产上常用的树脂1弱酸101×42弱酸110×3

3.精制主要杂质：链霉胍、二链霉胍、杂质1号精制方法：高交联度树脂精制浓缩和活性炭脱色精制将所得的精制液用硫酸或氢氧化钡调pH值至4.3～5.0，并按精制液透光度的不同加入不同量的活性炭，进行常温脱色，得透光度在95％以上的滤出液。由于链霉素是热敏感物质，受热易破坏，故宜低温快速浓缩。控制在链霉素最稳定的pH=4.0～4.5，进行真空薄膜蒸发浓缩，温度控制在35℃以下，浓缩液应达到35×104U/ml左右。成品浓缩液中，加入如柠檬酸钠、亚硫酸钠等稳定剂，经无菌过滤，即得水针剂。如欲制成粉针剂，将成品浓缩液经无菌过滤喷雾干燥后，即可制得成品。单元三抗生素类药物的发酵生产项目四链霉素的发酵生产

任务一链霉素基本知识1.链霉素的结构链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员，是由链霉胍、链霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷。N－甲基－L－葡萄糖胺链霉胍链霉糖链霉素又称链霉素A，其化学名为N-甲基-α-L-葡萄糖胺-（1→2）-a-L-链霉糖-（1→4）链霉胍。链霉素中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇后，就成为双氢链霉素，它的抗菌效能和链霉素大致相同，目前临床上使用的是链霉素和双氢链霉素的硫酸盐。2.链霉素的主要理化性质物理性质稳定性溶解度光学性质链霉素盐类的性质链霉素的降解反应氧化和还原反应醛基反应（1）物理性质链霉素游离碱为白色粉末。大多数盐类也是白色粉末或结晶，无臭，味微苦。链霉素分子中有3个碱性基团，在水溶液中随pH值不同可能有四种不同形式存在。当pH值很高时，链霉素成游离碱形式；当pH值降低时，可逐渐电离成一价正离子、二价正离子；在中性及酸性溶液中，成为三价正离子.链霉素在中性溶液中能以三价阳离子形式存在，可用离子交换法进行提取（2）稳定性链霉素比较稳定，空气和阳光对干燥粉末的影响不大。但链霉素的游离碱或其盐均易吸收空气中的水分而潮解，潮解后，稳定性显著下降。此外，成品中含有的杂质对链霉素的稳定性也有影响。链霉素的水溶液比较稳定，但其稳定性受PH值和温度的影响较大。链霉素水溶液最稳定的pH值为4.0～4.5。酸与碱对链霉素都有破坏作用。温度与链霉素水溶液的稳定性也有关。短时间加热，如在70℃加热30min，对活性无明显影响。但在高温时，短时间也会使链霉素的活性明显降低链毒素水溶液的失活程度与pH值、温度和时间有关。链霉素水溶液最稳定的pH值为4.0～4.5。酸与碱对链霉素都有破坏作用。图3-20链霉素失活速率常数与溶液pH值和温度的关系图3-21链霉素失活速率常数与溶液放置时间和残存百分率之间的关系由于链霉素有醛基，因此有些氧化剂和还原剂也可以减低链霉素的效力，其中氧化剂有高锰酸钾（KMnO4）、硝酸、高碘酸钾（KIO4）、过氧化氢等，还原剂有次亚磷酸二氢钠（NaH2PO3）、亚硫酸氢钠（NaHSO3）和硫代硫酸钠等。（3）溶解度由于链霉素分子中含有很多亲水性基团（羟基和氨基），故易溶于水，而难溶于有机溶剂中。链霉素盐酸盐易溶于甲醇，难溶于乙醇，而硫酸盐即使在甲醇中也很难溶解，

链霉素硫酸盐的溶解度（28℃）

（4）光学性质链霉素盐等含有许多不对称碳原子，都具有旋光性。（5）链霉素盐类的性质链霉素是一种有机碱，可以和很多无机和有机酸形成盐类,医疗上使用的是硫酸盐。有些盐类不溶于水，如链霉素和一些磺酸、羧酸、磷酸酯等形成

的盐类。不溶于水，可溶于有机溶剂中。利用此性质可用溶剂萃取法提取链霉素，所用的溶剂有：对甲苯磺酸、月桂酸、硬脂酸、二异辛基磷酸酯等。也可利用此性质，将链霉素从发酵液中直接沉淀出来。可用的沉淀试剂有二号橙、对-α-羟基萘基偶氮、苯磺酸钠、甲基橙、萘酚蓝黑等。不纯的链霉素通过形成某些盐类，在适当条件下再将盐分解，就能得到高纯度的链霉素。可用于沉淀的酸有：磷钨酸、苦味酸，甲基橙、雷纳克酸等。磷乌酸与链霉素形成白色沉淀的反应，在生产上，可用于定性鉴别试验。链霉素还能和某些盐类形成复盐，可用于精制反应。str•3HCl氯化钙甲醇溶液C21H39O12N7•3HCl•1/2CaCl2）阴离子交换树脂复盐转变为硫酸盐（6）链霉素的降解反应H+，H2ONaOH麦芽酚遇氯化高铁溶液显紫色，可测定链霉素效价链霉胍+N-甲基-L-葡萄糖胺+麦芽酚链霉素链霉素链霉胍+链霉二糖胺N－甲基－L－葡萄糖胺链霉胍链霉糖所含的醛基受某些氧化剂或还原剂的作用，容易发生反应。

链霉素被溴水氧化后形成链霉素酸链霉糖中的醛基被还原生成双氢链霉素1.直接还原法：以活性镍铅合金或氧化镉为催化剂，在高压下通入氢气，对硫酸链霉素进行氢化，即可制得双氢链霉素。2.电解还原法：将链霉素溶液放在电解阴极槽中，通入适量电流，就可达到还原作用。3.化学还原法；即利用某些能生成活性氢的化合物，将链霉素还原成双氢链霉素。工业上常采用钾硼氢（KBH4）或钠硼氢（NaBH4）作为还原剂。（7）氧化和还原反应（8）醛基反应可与伯胺（R-NH2）、羟胺（NH2OH）、NH3或NH4+作用。与伯胺（如苯甲胺）反应形成希夫碱沉淀。希夫碱在水中不易分解，可与不含醛基的链霉胍、杂质1号（由链霉胍和双氢链霉糖两部分所组成的糖苷）等杂质分开，可用于提纯精制链霉素。Str-CHO+H2NRH2O,H+Str-CHO+H2NRStr-CH=N—RH2O,OH-席夫碱3.链霉素的抗菌作用和应用范围链霉素的抗菌范围较广，抗菌效果不是很强，但对结核杆菌具有很强的敏感性，因此现在仍然是临床上治疗结核杆菌感染的首选药物。链霉素对革兰阴性菌的抗菌作用，可以补充青霉素对革兰阴性菌作用不明显的缺点。链霉素和青霉素在临床上联合使用，呈现协同现象，能增加对方的抗菌效果。4.生产菌种灰色链霉菌(S.griseus)

灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形，孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子呈白色。常用诱变剂物理诱变剂

紫外线，