气相及液相课件

化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室目录色谱学基本概念一气相色谱结构及应用二液相色谱结构及应用三化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱学基本概念化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱法的分类按操作形式分为：纸色谱法(PC)薄层色谱法(TLC)柱色谱法按两相的物理状态分为：气相色谱法(GC)液相色谱法

(LC)

化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱的工作原理化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱法分析对象

气相色谱：（占目前已知化合物的20-25%）

分子量小可挥发低沸点（一般不超过500摄氏度）热稳定性好

液相色谱：原则上其余化合物

化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱的基本概念化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室基本概念和原理拖尾因子：用以衡量色谱峰的对称性。T=A/B指10%峰高处的前峰宽A与后峰宽B的比值。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室基本概念和原理峰宽--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽--峰高一半处的峰宽。

化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室基本概念和原理噪音(noise)

基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。噪音化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室基本概念和原理死时间：t0保留时间：tR调整保留时间：tS化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室基本概念和原理《中国药典》规定R≥1.5时，两峰完全分离化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱分析的意义化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室

因为保留时间是唯一的定性数据，因此在色谱分析过程中，标准样品是必需的。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室定量分析化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气相色谱结构及应用化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气相色谱构成气路系统进样系统检测系统温控系统数据处理系统化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气路系统

气源：载气、检测器需要的辅助气气流控制装置：压力表、流量计、电磁阀、电子流量计化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气源来源钢瓶气体发生器优点气体质量有保障输送气体压力稳定一次性投入成本低使用方便（不用频繁更换）安全性高缺点需要经常更换（麻烦）氢气钢瓶放在室内存在危险气体质量差一次性投入成本高化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室载气可用做载气气体：

N2、H2、He等，保证载气纯度在99.999%以上。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气路控制系统手动调节：通过多重压力表对气流进行控制。自动调节：通过电子流量计或电磁阀进行自动控制。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室电子流量控制优点流量控制准确，重现性好可实现气体的多模式操作使仪器体积更小使仪器自动化程度更高仪器更省气操作更安全化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室最小检测线和最小定量限化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室温控系统

进样口

根据样品的性质确定，太高容易造成样品的分解，太低会使样品气化不完全柱温箱等温程序升温程序检测器

检测器的温度总是比柱的温度高。

通常比柱箱的程序升温的最终温度高20-30℃化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室柱温与分离的关系化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室研究了一种同时测定水中两种多环芳烃（萘、蒽）和三种酞酸酯（邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)）的固相微萃取-气相色谱（SPME-GC）方法。

固相微萃取技术（solidphasemicro-extraction，SPME）技术是种集萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新方法。目前，SPME除了在食品、药物和毒理学等研究领域得到广泛应用.

样品前处理：取40mL水样于样品瓶并加入小磁子，插入萃取针(纤维浸入并处于中心位置)，水浴控温45℃，磁力搅拌60min，萃取结束退出纤维拔出萃取针，在气相色谱进样口解析5min。

气相色谱应用实例一SPME-GC法同步分析水中多环芳烃和酞酸酯化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室SPME-GC法同步分析水中多环芳烃和酞酸酯A:经固相微萃取后5种物质标准样品色谱图；B:经固相微萃取后自来水样品色谱图AB气相色谱条件：GC-2010气相色谱仪，配FID检测器；HP-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)柱温起始70℃，保持8min，以30℃/min升至170℃，保持4min，以30℃/min升至280℃，保持8min；气化温度280℃；检测器温度300℃。载气：N2，柱流量：1.0mL/min；H2：47mL/min；空气：400mL/min；不分流进样。

化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气相色谱应用实例二SPME-GC-FTD法测定人尿液中毒鼠强含量毒鼠强结构式

样品前处理：样品离心后，直接取5mL于样品瓶中，插入萃取针，水浴控温50℃，磁力搅拌12min，萃取结束退出纤维拔出萃取针，在气相色谱进样口解析3min。

最低检测限：0.02ng/mL，比文献报道的最低检测限低一个数量级化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室SPME-GC-FTD法测定人尿液中毒鼠强含量气相色谱条件：柱温起始150℃，以10℃/min升至200℃，然后以20℃/min升至280℃，保持2min；气化温度245℃；检测器温度310℃。载气：N2，线速度：2.0mL/min；H2：2.0mL/min；空气：150mL/min；不分流进样。

GC-2010气相色谱仪，配FTD检测器；VO-17石英毛细管柱(30m×0.53mm×0.5μm)固相萃取后阳性尿液样品色谱图固相萃取后标准品色谱图化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气相色谱应用实例三气相色谱法测定脂肪酶活力原理：传统滴定法操作繁琐，样品消耗量大，重现性差。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室样品处理：底物乳化液100μL,pH7.5的Tris-HCl缓冲液200μL，酶液200μL。在32℃水浴反应5min后，加入乙腈800μL终止反应,振荡10s，离心10min（10000r·min-1），取上清液进样分析。仪器条件：HP5890气相色谱仪带FID检测Supecl-NUKOLTMFFAP毛细管柱；（30m×0.53mm×0.5μm)，柱温100℃，保持5min，以20℃·min-1的速率升温至180℃后，保持6min。分流。进样口温度250℃，检测器温度250℃，载气（氮气）流速10mL/min，氢气流速30mL/min，空气流速300mL/min，尾吹30mL/min。进样量1μL。气相色谱法测定脂肪酶活力A:正丁酸样品色谱图B:样品色谱图

1：正丁酸化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室气相色谱应用实例四样品前处理：精密称取五味子药材（粉碎）0.200g置于50mL容量瓶中，加入甲醇定容并称重，超声（125W，40Hz）提取40min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量后作为供试品溶液以备用。仪器条件：HP-5890气相色谱仪，FID检测器，HP-3365化学工作站。HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.，0.25μm液膜厚度)；程序升温，起始温度为210℃，保持1min，以2℃/min升温至230℃，保持30min；进样量1μL，分流比：10：1，载气：氮气，1ml/min；进样口和检测器温度为280℃。气相色谱法同时测定五味子中三种木脂素的含量

（A）对照品和（B）样品色谱图1：五味子甲素；2：五味子乙素；3：五味子醇甲化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室液相色谱结构及应用第三部分化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室液相色谱发展历史经典液相色谱：室温、常压柱效低、时间长（常有几个小时）现代液相色谱：

高效液相色谱：HighperformanceLiquidChromatography，HPLC填料颗粒小而均匀高压输送流动相又称高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别934150检查1240160含量测定760117387化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室液相色谱分类按原理分为：吸附色谱法（AC）

分配色谱法（DC）离子交换色谱法(IEC)排阻色谱法(EC)，又称凝胶过滤色谱（GFC）亲和色谱法(AC)分配色谱按固定相和流动相极性分为：正相色谱和反相色谱化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室固定相与流动相反相HPLC

极性:固定相<流动相固定相-极性弱流动相(甲醇,乙腈等)-极性强极性小物质后出峰正相HPLC

极性:固定相>流动相固定相-极性强流动相(己烷,庚烷)-极性弱极性物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相色谱20%反相色谱80%主流化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室液相色谱构成溶剂传输系统高压泵样品引入系统进样器样品分离系统色谱柱信号检测系统检测器数据处理系统软件化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室溶剂传输系统贮液罐流动相输液泵梯度洗脱装置化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室贮液罐存放流动相的容器材料通常为玻璃，不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等。

不能使用塑料容器容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室流动相流动相应不改变填料的任何性质纯度：分析纯或色谱纯必须与检测器匹配粘度低对样品的溶解度要适宜。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室流动相的选择在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室流动相的选择参考资料：乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的6~7倍。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水。乙腈的截止波长为190nm，甲醇的截止波长为205nm。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室流动相的pH值反相离子抑制技术：采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室缓冲盐流动相注意点(1)现配现用.低温下密封保存一般不超过3天。(2)确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）(3)冲液必须过滤膜。(4)使用缓冲液期间，用注射器推纯水，清洗柱塞杆，延长泵密封垫寿命。(5)工作完毕后及时冲洗LC系统缓。(6)梯度洗脱时,确认不同比列的缓冲液与有机溶剂能互溶。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室流动相的过滤和脱气流动相的过滤滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。

尼龙66滤膜：

适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：

1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积

2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形

3）检测器中的气泡产生基线波动化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室脱气的目的

1.防止由气泡的产生引起的故障

2.防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测不稳定程度

1）示差折射率检测器*使折射率变化

2）UV检测器（200nm以下）*溶解氧气有吸收

3）荧光检测器*溶解氧气有消光作用化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室脱气方法1.低压脱气法（真空脱气法）2.吹氦脱气法超声波脱气法在线脱气法化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室往复式输液泵结构流动相泵头清洗管路柱塞杆密封圈化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室并联泵与串联泵串联往复式泵：Waters600泵，岛津10AD泵并联往复式泵：Agilent1100系列，岛津10AT泵串联柱塞泵消除流量脉冲

并联柱塞泵减小流量脉冲

单向阀结构化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室梯度洗脱装置高压梯度洗脱低压梯度洗脱1-四通；2-混合器泵控制器；

3-高压输液泵；A,B,C-电磁比例阀，a,b,c-溶剂瓶1，2-泵；3，4-泵控制器；

5-梯度程序控制器；6-混合器化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室进样系统手动进样器自动进样器化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室手动进样器的原理图

装填状态进样状态化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室六通阀进样方式：部分装液法：进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。完全装液法：进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应阀清洗接头和注射器冲洗进样阀，防止交叉污染。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室自动进样器注意事项：样品瓶中应有超过瓶高1/3的样品量样品瓶中样品不要装太满，应留有一定的空气。使用与仪器配套的样品瓶。机械手样品盘化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室洗针溶剂根据流动相的不同应有所不同。化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱柱色谱柱结构：柱管，卡帽，卡套，筛板，接头，螺丝等化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱柱色谱柱的分类：色谱柱按用途可分为分析型和制备型尺寸规格：①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm；②窄径柱（narrowbore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm；③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm④半制备柱，内径＞5mm；⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室柱填料基质化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室硅胶填料物理性质物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室硅胶填料化学性质键合类型碳覆盖率封端化学性质化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室C18硅胶填料结构化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室高效液相色谱检测器UV荧光示差折光蒸发光散射信号吸光度荧光强度折光率散射光强流速影响无无无无温度影响小小大小检测限(g/ml)10-1010-1310-710-9梯度洗脱适宜适宜不宜适宜细管径柱难难难适宜样品破坏无无无无通用型否否是是化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室紫外检测器工作原理：

通过测定样品在检测池中吸收紫外-可见光的大小来确定样品的含量。

朗伯-比尔定律：

当一束单色光辐射通过物质溶液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。

A=εbc

A:吸光度；E：吸光系数；b：光路长度；c：溶液浓度

对于给定的检测池（b一定），在固定的波长下（ε一定），紫外检测器的输出一个与样品浓度（c）成正比的光吸收信号——吸光度（A）。

分类

紫外-可见光检测器

光电二极管阵列检测器（PDA或DAD）化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室紫外-可见光检测器（UV-Vis）结构1-氘灯；2-透镜；3-滤光片；4-夹缝；5-放射镜；6-光栅；7-分束器；

8-参比光电二极管；9-流通池；10-样品光电二极管化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室光电二极管阵列检测器(PDA/DAD)结构1-氘灯；2-光源转化镜；3-钨灯；4-反射镜；5-入口狭缝；6-扇形镜；

7-圆形镜；8-参比吸收池；9-样品吸收池；10-准光镜；

11-分光器入口狭缝；12-平面镜；13-光栅；14-光电二极管阵列化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室荧光检测器(FD)原理：化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室荧光检测器结构1-中压汞灯光源；2-10%反射棱镜