单克隆抗体制备方案

10单克隆抗体制备方案细胞融合前预备一、动物免疫动物Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。为避开3～4只小鼠。免疫原制备15ml15个、50ml7个、10ml5支、Tip20个、电子天平、CFA、PBS、CFA〔使用前需震摇〕50μg/80mg10mlPBS中，充分混匀。取1ml7mlPBS中，50ml10mlCFA用注射器反复推吸。取一滴参加水中，假设不马上散开，则乳化好。4℃保存。80mg10mlPBS1ml3mlPBS中，1ml9mlPBS50ml10mlCFA用注射器反复推吸。取一滴参加水中，假设不马上散开，则乳化好。4℃保存。90mg10mlPBS1ml2mlPBS中，1ml9mlPBS50ml10mlCFA用注射器反复推吸。取一滴参加水中，假设不马上散开，则乳化好。4℃保存。80mg10mlPBS1ml1mlPBS中，1ml9mlPBS50ml10mlCFA用注射器反复推吸。取一滴参加水中，假设不马上散开，则乳化好。4℃保存。100mg10mlPBS1ml1mlPBS50ml10mlCFA于该离心管中。反复摇摆，用注射器反复推吸。取一滴参加水中，假设不马上散开，则乳化好。4℃保存。试验步骤1ml，0.2ml/点，3只承受腹腔注射〕3周后其次次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂IF下注射3周后第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价2～3周后加强免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。腹腔注射

3～4天后取脾细胞融合将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进展注射。进展腹腔注射时应留意：1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则简洁刺入皮下。3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。、为避开注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。皮下注射右手持注射器将针头刺入，固定后即进展注射。一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。留意事项上增加。1:1。说明未乳化好。ELISA间接法、免疫双集中法、环状试验等。用双向免疫ELISA后可用于融合。皮下注射给药住进针部位片刻，以防止药物外漏。二、脾淋巴细胞试剂4g100ml，40.1mol/LPBS0.4％w/v1ml4%9ml0.1mol/LPBS。RPMI-1640培育液10%FCS-1640培育液试验步骤①加强免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗体检测时的阳性比照。试管静置30～60min后，将血块轻轻剥离管壁，3000r/min15～20min，吸取上清〔血清〕4℃冰箱保存备用。751min菌条件下取出脾脏置于盛有10ml不完全RPMI-1640培育液的平皿中，轻轻洗去脾脏上的红细胞并细心剥去四周结缔组织，于盛有10ml的RPMI-1640培育液的无菌平皿中过不锈钢筛网用注射器针芯研磨脾脏后用玻璃吸管吹打数次制成细胞悬液，10ml离心管中。50ml离心管中⑤以RMPI-164050ml1000r/min10min，弃上清10mlRPMI-1640培育液重悬⑦重复⑤⑥步骤⑧计数活细胞：把细胞悬液稀释到约106个/ml，将计数板及盖片擦拭干净，并将盖0.9ml细胞悬液和0.1ml浓度0.4％的台盼蓝工作液于EP管中，充分混匀中静置1～2min，不超过5min。假设染色时间太久，细胞将下沉或受损，而且局部活细胞也会着色。用加样器留神混匀细胞悬液后，马上用微量加样器将其加于血球计数板，置于倒置显微镜下观看并计数活细胞和死细胞。死细胞被80%为合格。留意事项①取样计数前应充分混匀细胞悬液。②数细胞的原则是只计数完整的细胞，镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，假设细胞团占10%以上，说明分散不好，需重制备细胞悬液。假设细胞压在格线上时，只计上侧和左方的。③操作时留意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重计数。22×108左右。三、饲养细胞①10～12Balb/c753min～5minFCS-1640培育液注射到小鼠腹腔〔严禁刺破肠管〕3min～5min后，用无菌剪刀剪开小鼠腹部一小口，用圆头尖吸50ml离心管中。吸的过程肯定不要刺破肠管以免细菌污染。1200r/min5min～6min10%胎牛血清〔FCS〕1×105个/ml96100μl37℃CO2培育箱中培育.四、骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞介绍细胞株。骨髓瘤细胞适合于一般的培育液，如RPMI1640，DMEM培育基。细胞的最大密度106个/ml1∶103～5天传代一次。细胞的倍增16～20SP2/0细胞为悬浮或稍微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。在细胞融合的前一天用颖的10%F2.0×105个/ml1×107～6×107对数生长期〔即15h～20h〕的骨髓瘤细胞，于室温1000g〔3000r/min〕离心10min收集沉淀，以无个/ml。经胎盼蓝染色活细胞数>95%。SP2/0细胞是肿瘤细胞株，一般注射到小鼠体内约1周左右就可以使小鼠致死。在其状态萎靡的时候就可以用根底培育基洗出其腹腔中的细胞，分别SP2/0细胞。整个过程要保证无菌，否则就前功尽弃了。为了防止骨髓瘤细胞〔HGPRT缺陷株〕变异消灭返祖现15μg/ml20μg/ml8－氮鸟嘌呤(8-AG)的培育1～2周即可用于8-AG一般试剂公司都有〔Sigm8-AG。细胞培育彻底消毒。30～60min，试验做完后再用紫外灯照耀紫外线灯，关后格外钟即可进入。10～30min，然后让超净工作台预工作10min～15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。75%0.2%洁尔灭消毒手和用消毒液洗手。75%区域操作。CO2钢瓶的压力、CO2培育箱中CO2浓度、温度、及水盘是否有污染〔水盘的水用无菌水，每周更换。〔切不行用酒精擦拭有机玻璃挡板。过的玻璃器皿30min以上，然后加少许清洗剂，以超声波洗涤30min左右，(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净)，捞出晾干，再在铬酸洗液10-153-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。细胞要常常冻存，只要细胞状态好就将细胞冻存起来。,圆形光明,排列整齐,0.1×个/ml90%～95%。细胞传代0.25胰蛋白酶〔25cm22ml，75c2胰蛋白酶参加100mlD-hanks液中，滤膜过滤除菌，分装4℃保存。使用时温度在37℃左右为宜。5ml吸管、Tip头、加样器、培育瓶细胞冻存试验器材及试剂RPMI-16406.8ml2ml，DMSO1.00.1ml，5.6%NaHCO30.1ml。NaHCO3可在超净台内经过滤膜除菌。DMSO在常温下有毒，在配置冻存液时，留意保护自己，带好手套。最好现配现用。显微镜、-80℃冰箱、纱布试验步骤一次培育液。800～1000r/min5mi〔1000r/mi5min3～5min太短达不到预期效果。1×106个/ml～1016个/ml〔5106个/ml。1～1.5ml。可用胶带密封。每个冻存管上标明冻存时间、细胞名称、操作者等。此外还应记录每个冻存管中的细胞数量。430min。-2030min。⑦将细胞转移至-80℃16～18小时〔或隔夜。留意

⑧最终匀速下降至液氮中。1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡。②原则上细胞在液氮中可储存多年，但为妥当起见，冻存11次，然后再连续冻存。DMSO430～60min后使用。细胞生长曲线MTT比色试验检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT复原为不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶490nm波特长测定其吸光度值，可间接反映活细胞的数量。MTT比色法计数为A质计算出细胞数。试剂及试验器材pH7.4〕在电磁搅拌机上搅拌30min，用0.22 m的微孔滤膜除菌，分装，4℃保存，两周内有效。保存在-20度长期保存，避开反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。RPMI-1640培育液、0.25%胰蛋白酶消化液、DMSO、96孔培育板、10lTip头、酶标仪、振荡混合器、显微镜、离心管制作标准曲线：预备细胞悬液，从1×107个/200l/孔开头在96孔平板中倍比稀释至102个/200l/3374h后细胞贴壁，每孔中参加20lMTT4h～6h，终止培育，对于悬浮生长的细胞，需离心〔1000r/min，5min150lDMSO10min，使甲臜充分溶解。度值。制作生长曲线：调整细胞的浓度，按2×103个/200l/孔接种在9610块203712hMTT比色法测定一块板中细〔A〕为纵轴绘制出细胞的生长曲线。留意10%胎牛血清的培育液进展试验。呈色后尽量吸净培育孔的培育液。细胞计数法细胞培育瓶30个、台盼蓝、计数器、显微镜、计数板、盖玻片104/ml7ml，12h用台盼蓝计数其中的细胞数。SP2/0虽为半悬浮生长，但悬浮细胞多为死细胞2～3天可吸掉培育液并参加等体积的培育液。吹打前用右手紧握培育瓶使其平放在手心，右手从右侧拍击培育瓶壁4～5次，不要让培育瓶晃动猛烈而形成泡沫。细胞复苏40℃并等到温度到达再开头复苏过程、15ml离心管、RPMI-164010%1640培育液、CO2培育箱、Tip头、低速离心机3720min，备用。37℃水浴中，快速摇摆，直至冻存液完全溶化。15ml10〔1000r/min5mi。105个/ml，CO2培育箱中培育。⑤记录复苏日期。⑥次日更换培育液，连续培育【留意事项】氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。DMSO对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，1-2min内使冻存液完全溶化。假设复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。DMSO最好选择进口产品。DMSO浓度较高，留意参加少量培育液可稀释其浓度，以削减对细胞的损伤。1％。所以1010ml以上的培育基就恰好稀释到了无害浓度。五、细胞融合，选择杂交瘤用作细胞融合剂的聚乙二醇〔PEG〕4000者，该分子量的PEG呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他很多有机溶剂，对热稳定，与很多化学。通常选用供气相色谱用的高纯度PEG做融合剂。SP2/0细胞，用无血清的RPMI-16403次800r/min5min5mlRPMI-1640培育液中，计数活细胞，置冰上备用。试剂及试验器材RPMI-1640、离心管〔50ml50个、10ml吸管〔10支、无菌棉签〔约一包50PE〔4000pH7.4～8.050mlHAH24孔培育板〔50块、Tip头〔100个、较大的滤膜〔5个〕试验步骤〕的比例50mlRPMI-16401200r/min8min。2次。②留神吸出上清，颠倒离心管使管口向下，用无菌棉球吸净残留液体以避开稀释PEG。37℃370.8ml0.7ml50%〔PEG此时肉眼可见有颗粒消灭，滴加过程要求持续60s，37℃静置90s5min20ml37℃预温的无血清RPMI-1640培育液以终止融合剂的作用，1min1ml，第2min2ml，后3min17ml，边滴加边摇动。800r/min7min沉淀细胞10ml490ml10％FCS-1640培育液中。240.5ml5%CO237℃培育箱中培育4HAT〔些液体至肯定的高度，依据需要参加适量的饲养细胞〕1416日参加HTHT〔100×5ml495ml10%FCS-1640交瘤细胞消灭后，吸取上清液，检查抗体，及早液氮冻存备份和克隆化。留意事项10～201个月左右才能消灭的。而且每个细胞群落明显。适宜的无菌操作技术。下会消灭成团的细胞，影响本就不高的融合率。1.PEG有毒性或作用时间过长。2.牛血清的质量太差，用前没有进展严格的筛AHT含量缺乏。1/10以上时，即可检测抗体阳性孔，连续三次检测渐渐上升或维持在同一水平者，则可以做克隆化，一局部则冷藏起来长期保种用。六、抗体检测〔ELISA间接法〕试验仪器96孔微量反响板，微量加样器，1.5ml离心管。试验试剂α-LA酶标抗抗体〔酶标二抗IgG-HRPIgM-HRP包被液〔pH9.5N2CO31.59，NaHCO31000ml0.02%NaN3，0.22m膜过滤，4℃保存〔0.01mol/LpH7.4PBS-pH7.4PBSNacl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.1g，KCl0.2gHClNaOH调整配制成洗涤缓冲液DMSO1mg/mlTMB溶液，4℃避光保存。用前要检查其状态，假设有凝固，可用手温将其溶化。底物缓冲液〔pH5.1.02gNaHPO4.122O3.68g100ml4H2O2。使用前按TMB：底物缓冲液：H2O2100：900：19ml加1ml10μl30%H2O2(即配即用)10%的小牛血清〔1ml9ml1×PBS中混匀〕2mol/LH2SO43.试验步骤的碳酸盐包被缓冲液〔pH9.5〕8μg/ml，每个聚100μl，4℃过夜。次日倾去凹孔内的液体，用洗涤液洗3～5次。10%200μl，371～2h，3～5〕100μl37℃1～2h，洗涤，同时做空白、阴性及阳性孔比照涤液洗涤，最终一遍用双蒸水〔DDW〕洗涤TMB100μl，3720～30min2mol/L50μl结果。也可在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白比照孔调零后测各孔OD值，OD2.1倍，即为阳性。七、杂交瘤细胞的克隆化〔有限稀释法〕96100l饲养细胞液〔1.0×105胞〕10%血清的HT培育基稀释至10个细胞/ml，0.1ml1个细胞。2③375%CO培育7～10到杂交瘤细胞布满孔底1/3面积即可检测抗体；标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。2④取抗体检测阳性孔消化分别细胞，并转种于24孔板中扩大培育。并冻存。留意事项：不易观看，最好两个人进展确认。3～5次克隆才能稳定。八、杂交瘤细胞的冻存10%FCS-1640培育液10%FCS-1640反复轻轻吹打贴附在瓶壁上的细胞，使细胞均匀分散悬浮③1000r/min离心10min，弃上清液。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液，1.0×107细胞/ml④取样，用无血清培育基把细胞悬液稀释到200～2023个/毫升，和0.4％的胎盘蓝溶液按1:1轻轻混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观看，计数，因活细胞排斥台盼兰，不被染色，其中蓝色细胞是死细胞。存活率应在95%以上 ⑥分装冷冻管，冷冻管要将盖子盖紧，每瓶0.5～1ml，在酒精灯上封口冷冻管42h〔-70℃〕15h，最终沉入液氮中〔-195℃〕九、单克隆抗体的生产及纯化动物体内生产单抗月龄〕0.3～0.5ml，7天后使用②收集对数生长期的杂交瘤细胞，用生理盐水洗涤两次，1500r/min10min5×106个细胞/ml的悬液0.5ml处于对数生长期的杂交瘤细胞2～35～10ml5～10mg/ml分装-70℃冻存备用。单克隆抗体的纯化〔饱和硫酸铵盐析沉淀法〕试验材料及试剂生理盐水：0.9gNaCl100ml蒸馏水中，高压灭菌0.01mol/LpH7.4PBS1000ml蒸馏水中溶解Nacl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.1g，KCl0.2gHClNaOHpH7.420min，保存于室温。搅拌使大局部晶体溶解，室温静置过夜，可见局部硫酸铵结晶析出，沉于瓶底，上清即pH528%pH7.2.过滤备用磁力搅拌袋，透析袋试验步骤4℃12023r/min15min，去