免疫组织化学课件

免疫组织化学免疫组织化学1掌握内容免疫组化的基本原理免疫组化的基本过程免疫组化的染色技术分类常用的免疫组化的染色原理和方法注意事项掌握内容免疫组化的基本原理2免疫组织化学的基本概念Immunohistochemistry又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用免疫学原理（特异的抗原抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位检测技术。免疫组织化学的基本概念31．发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功60年代Nakane建立酶标抗体技术70年代Stemberger改良上述技术，建立过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。1．发展简史480年代Hsu等建立了抗生物素的（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。80年代Hsu等建立了抗生物素的（ABC）法之后，免疫5免疫组织化学的优点1、特异性强——免疫组化从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示2、敏感性高——抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合3、定位准确，形态与功能相结合4.方法步骤统一——若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。免疫组织化学的优点1、特异性强——免疫组化从理论上讲也是“一6免疫组织化学的基本原理应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究免疫组织化学的基本原理应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，7基本过程抗原提取制备抗体抗体标记制备样品免疫前样品处理免疫反应显色反应观察分析基本过程抗原提取8一、提取抗原（antigen，Ag）生物化学各种方法提取抗原一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质。基本特性：一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是反应原性一、提取抗原（antigen，Ag）9抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇10表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体11抗体蛋白分为V区和C区，V区高度可变，是识别抗原的区域，C区是很保守的抗体蛋白分为V区和C区，12二、制备抗体即多克隆抗体（PcAb）单克隆抗体（McAb）和基因工程抗体二、制备抗体13整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体的制备和选择原则：种属差异越大越好整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技14抗体的储存新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。1、4℃保存（6个月）2、低温保存（-70℃～-20℃，5年）3、真空干燥保存（5～10年）4、稀释的抗体不能长时间保存，在4℃可存放1~3天，超过7天效价显著降低。抗体的储存新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为15抗体的储存注意：1、保存前需经除菌2、保存液含防腐剂（浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间；酶标记抗体不能用NaN3，会抑制酶的活性）3、避免反复冻融，分装（10ul或100ul/支）抗体的储存注意：1、保存前需经除菌16抗体稀释的配制：

常用0.01mol/LpH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。

抗体稀释的配制：17

抗体的最佳稀度倍数：由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。抗体的最佳稀度倍数：由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强18三、抗体的标记物荧光素——异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸罗达明(TRITC);德克萨斯红；藻红素等酶——碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等金属：胶体金、胶体铁、铁蛋白等亲和素、生物素、放射性同位素等三、抗体的标记物19四、样品的制备组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。

标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞四、样品的制备组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化20标本的固定与保存好的固定剂除能满足一般组织学固定目的外，还需要：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应标本的固定与保存好的固定剂除能满足一般组织学固定目的21常用：10%福尔马林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液常用：10%福尔马林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚22固定方法细胞表面抗原——新鲜冰冻切片，后固定于丙酮单层细胞、病毒、细菌——冷丙酮、冷乙醇细胞悬液——先固定，然后离心制成标本可溶性抗原——甲醛蒸气一般组织——新鲜取材、浸泡固定固定方法细胞表面抗原——新鲜冰冻切片，后固定于丙酮23切片方法冰冻切片石蜡切片：乙醇脱水时间要短；浸蜡要快，温度低于60℃；玻片上要用黏附剂蜡块尽快切片，密封保存在4℃；染色前彻底脱蜡一般为5μm盖玻片、载玻片清洗干净，载玻片要涂黏附剂：明胶硫酸铬钾法、多聚赖氨酸等切片方法冰冻切片24五、免疫反应前的处理

1、抗原修复福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖。因此，抗原修复是影响免疫组化染色结果的基本因素

五、免疫反应前的处理

1、抗原修复福尔马林固定时，组织中的许25抗原修复(Antigenretrieval，AR)技术抗原修复是指切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。抗原修复(Antigenretrieval，AR)技术抗26AR非加热技术：蛋白酶消化或酸水解加热技术：微波、水浴、高压锅AR非加热技术：蛋白酶消化或酸水解27酶消化

(1)原理：

1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白

2)断交联酶消化

(1)原理：

1)去除覆盖于抗原决28胰蛋白酶：0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1NNaOH调pH至7.8。消化时间37℃30min。

主要用于细胞内抗原的修复胰蛋白酶：0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用029胃蛋白酶

0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀释，消化时间37℃30～180min。主要用于细胞间抗原的消化。

此外还有蛋白酶K、链酶蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等（细胞内抗原修复）

工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀释，消化时30修复方式：

①微波96℃±10min×2；

②直接加温100℃，15min；

③水浴锅100℃，15min；

④高压锅/消毒锅120℃，5min；

⑤真空加热10min；

修复方式：

①微波96℃±10min×2；

②直接加温131修复介质：

①0.01MpH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；

②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);

③0.01MpH7.0PBS;

④2%硫酸铝；⑤2％硝酸铝；⑥生理盐水；⑦蒸馏水。

修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。修复介质：

①0.01MpH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；32形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。

热处理后自然冷却形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞332、冰冻切片或细胞涂片的处理一般不需抗原修复一般脂质细胞膜保存完整（除非用丙酮、乙醇固定）为了使抗体等大分子透过，需在膜上打缺口2、冰冻切片或细胞涂片的处理一般不需抗原修复34冰冻切片或细胞涂片的处理1、非离子型表面活性剂：TritonX-100等0.1%-0.5%，加入漂洗液或抗体稀释液中使用2、将固定并粘附的载玻片通过上升乙醇到二甲苯，再下降乙醇到水3、反复冻融：蔗糖防冻处理，低温-70℃速冻，室温融化，反复2-3次。冰冻切片或细胞涂片的处理1、非离子型表面活性剂：Triton35免疫反应前处理——3减少非特异性着色1、内源性酶或生物素：用其特异性底物或亲和物将其封闭；2、离子和电荷吸附：用特异性抗体来源的同种动物灭活非免疫血清，预处理。结合弱，不冲洗3、一抗的稀释程度：预实验4、冲洗程度：除了封闭血清不需要冲洗之外，其余每一步都需液冲洗3次～5次。常用PBS免疫反应前处理——3减少非特异性着色1、内源性酶或生物素：用36六、免疫组织化学的主要方法根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法②间接法③多层法六、免疫组织化学的主要方法37直接法荧光素或酶等直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）优点：简单，时间短，特异性强。

缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济），每一种抗原都需制备其标记抗体应用：基本不用了！（免疫荧光染色法除外）直接法38间接法

标记物标记在二抗上。显色后镜检

特点：较直接法灵敏（一抗上至少可以结合两个二抗）；带标记的二抗，可定位多种抗原常用与免疫荧光、免疫金技术间接法

标记物标记在二抗上。显色后镜检

特点：较39多层法多层法40按标记物的性质分成①免疫荧光技术②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）六、免疫组织化学的主要方法按标记物的性质分成六、免疫组织化学的主要方法41

１.异硫氰酸荧光素FITC２.四乙基罗达明３.四甲基异硫氰酸罗达明４.藻红蛋白

▲呈现不同的荧光：绿色荧光(FITC)

橙色荧光

橙红色荧光

红色荧光等

免疫荧光技术１.异硫氰酸荧光素FITC免疫荧光技术42免疫荧光组织化学染色方法

1.直接法：简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。

操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。免疫荧光组织化学染色方法

1.直接法：简便、快速，用已知43(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。

(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。

(4)pH9.0甘油缓冲液（磷酸盐）封片。（必须无自发荧光，无色透明）

(5)镜检(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h44海马细胞

微管蛋白绿色(胞体、树突)

轴突终末蛋白红色(突触)海马细胞45

培养的成纤维细胞微管呈绿色核呈蓝色培养的成纤维细胞462.间接法是直接的重要改进，先用特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用荧光标记二抗与一抗特异性结合。2.间接法是直接的重要改进，先用特异性一抗与组织细胞内抗47荧光双标记技术应用免疫荧光技术在同一张组织切片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，即谓双重或多重免疫标记。此理论同时也可应用到其他免疫技术。如：免疫酶双重标记；免疫胶体金标记。显示的水平可以是光镜，也可以是电镜荧光双标记技术应用免疫荧光技术在同一张组织切片上同时或先后显48

常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素(FITC)呈绿色与罗丹明(RB200)或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色。技术方法敏感、特异，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样本不能长期保存。细胞结构不清晰常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素(FITC)呈绿色与49免疫酶组化免疫学(抗原抗体反应)

酶细胞化学(底物显色反应)+特异性敏感性定位性可视性免疫酶组化免疫学酶细胞化学+特异性敏感性50免疫酶技术基本原理：抗原＋［一抗］＋酶标记抗体或扛酶抗体通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。免疫酶技术基本原理：511、酶标抗体：酶分子与抗体分子共价结合，要求此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性2、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体反应，避免了共价结合，保护了酶和抗体的活性。1、酶标抗体：酶分子与抗体分子共价结合，要求此种结合既不改变52标记酶选择标准：★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。★酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。标记酶选择标准：53

★酶易于纯化，获得纯制品。★酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。★酶在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。

★酶易于纯化，获得纯制品。54常用的标记酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶常用的标记酶辣根过氧化物酶55（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位，易穿过细胞膜★稳定，耐受63℃加热15min，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性★可溶性佳，生成的产物不扩散★组织中内源性酶较少★可作用于多种底物，产生不同颜色（一）辣根过氧化物酶（HRP）56HRP的底物：

HRP的底物为低浓度的H2O2显色：DAB（二氨基联苯胺）HRP的底物：57内源性过氧化物酶的消除方法：

1.0.3%～3%H2O2甲醇液20min

2.1％H2O220min

3.3％苯肼溶液37℃1h

4.0.075%盐酸甲醇液30min内源性过氧化物酶的消除方法：

1.0.3%58（二）碱性磷酸酶（AKP）

从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取

●组织穿透能力较弱

●内源性AKP较高

●左旋咪唑具有抑制作用

（二）碱性磷酸酶（AKP）59AKP底物：

AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色

AKP底物：60内源性碱性磷酸酶的消除方法

1.10％醋酸10min

2.0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0）20min

3.1mol/L左旋咪唑20min内源性碱性磷酸酶的消除方法

1.10％醋酸1061（三）葡萄糖氧化酶（GOD）

底物为葡萄糖，终产物稳定●体内无内源性GOD●分子量大，穿透力较弱●分子具有较多的氨基，标记时容易形成广泛的聚合，影响酶的活性。多用于双标实验（三）葡萄糖氧化酶（GOD）62酶标记抗体法

酶标记抗体法（EnzaymeLabelledantibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。

酶标记抗体法63一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上抗原---抗体●HRP复合物一、直接法64组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法65步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。步骤：一步完成66二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●

HRP复合物步骤：二步法二、间接法67组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法一抗和二抗必须是不同种属的动物制备的，二抗是用第一种动物的IgG所制备的组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法一抗和二抗必须是不同68特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重。特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种69非标记抗体酶法（酶抗酶法）

酶不是作为标记物，而是作为抗原，用来制备抗这种酶的抗体酶桥法、PAP法

非标记抗体酶法（酶抗酶法）70酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体（桥抗体）第三抗体（抗酶抗体）HRP一抗和三抗需用同一种属动物制备二抗为抗上述动物IgG的抗体酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体（桥抗体）第三抗体（抗酶抗体）71酶桥法的优缺点优点：酶未标记在任何抗体上，而是通过免疫学原理与抗体结合的，避免了共价结合对之的影响；灵敏度高缺点：1、抗酶抗体中有高、低亲和力的两类抗体。低亲和力的抗体结合较弱，漂洗易丢失，降低敏感性2、抗酶抗体中，有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，也可与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响抗原的显示酶桥法的优缺点优点：酶未标记在任何抗体上，而是通过免疫学原理72PAP法原理：抗原---第一抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP复合物步骤：三步法PAP法73PAP复合物酶（HRP）和抗酶抗体的复合物3个酶分子＋2个抗酶抗体优点：结构稳定，冲洗时不会脱落；灵敏度大为提高；不易引起非特异性染色缺点：PAP复合物制备较复杂，分子较大，穿透力不强，不适合于电镜标本PAP复合物酶（HRP）和抗酶抗体的复合物74组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP一抗与PAP必须为同一种属动物

二抗必须过量组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP一抗与PA75双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP---第二抗体---PAP复合物

双PAP法：76组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP77双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP78步骤：五步法特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时步骤：五步法79免疫亲合技术原理：利用抗生物素（avidin）和生物素（biotin）的高亲和力。1个抗生物素分子可结合4个生物素生物素可结合标记大分子如抗体、酶等抗生物素可用酶、胶体金、荧光色素等标记与免疫酶法没有原则区别免疫亲合技术80一、ABC法Avidin-Biotin-peroxidaseComplextechnique抗生物素－生物素－过氧化物酶复合物技术一、ABC法81酶+Biotin＋Avidin---ABC复合物生物素化二抗抗原---特异抗体---Biotin标记的二抗---Avidin

●Biotin●HRP酶+Biotin＋Avidin---ABC复合物82组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素抗生物素ABC法组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素抗生物素ABC法83步骤：三步法特点：敏感性较高（比PAP高20－40倍）；特异性强；应用范围广步骤：三步法84

●某些脏器存在内源性生物素干扰（肝、肾、白细胞等）可预先用0.01％抗生物素和0.01％生物素溶液分别作用20min以消除，PBA冲洗干净●抗生物素与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应●某些脏器存在内源性生物素干扰（肝、肾、白细胞85免疫组化染色步骤1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。抗原修复2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3％H2O2（在PBS或0.05Tris—HCL缓冲液pH7.6中或甲醇中）室温，30分钟。3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。4．减少非特异性着色：用稀释5-20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30分钟。免疫组化染色步骤86

5．滴加第一抗体，4℃过夜或室温30′-3h。6．0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。7．滴加第二抗体，室温15′-60′。8．0.1MPBS洗净，洗三次，每次5分钟。9．滴加ABC复合物，室温15-60分钟。10．0.1MPBS洗三次，每次5分钟。

8711．0.05MTris–HCL5-10分钟，此步可省略。12．DAB—H2O2显色：用0.01％H2O2的DAB溶液，室温5-30分钟，随时镜检（DAB用时新配）13．自来水洗净。14．用Mayer苏木精或0.5％甲基绿，复染胞核（可不染）。15．常规脱水、透明、封固、镜检。结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。11．0.05MTris–HCL5-10分钟，此步可省88二、SABC法

StreptavidinbiotinPeroxidaseComplex（标记链霉抗生物素－生物素法）步骤相似，SABC法已代替ABC法二、SABC法89链霉亲合素（链霉抗生物素）——从链霉菌分离出来的一种蛋白质，与生物素也能特异性结合（4个结合位点）可以排除亲合素（抗生物素）与一些组织的内源性物质非特异性结合链霉亲合素（链霉抗生物素）——从链霉菌分离出来的一种蛋白质，90多聚合物酶法原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP---多聚合物---特异性抗体。

多聚合物酶法91组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法92步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵步骤：一步法93免疫组化染色基本技术注意事项1．Ab滴片技术所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。［注意］滴抗体前需把切片上的水甩干免疫组化染色基本技术注意事项942．Ab孵育技术（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。（2）温度与时间4℃：过夜，＞1637℃：1hor参考说明书3、整个染色过程不能干片免疫组织化学课件95▲染色失败的几种原因：（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。全部（－）原因可能：①染色未完全严格按照操作步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效；③