猪apobec3f基因多态性及其与prrsv易感性相关性分析

猪apobec3f基因多态性及其与prrsv易感性相关性分析

脂蛋白质bmrna编辑酶催化多边形3f（apobec3f）是apobec家族的成员。它具有广泛的抗炎性，可以有效地抑制人类免疫缺陷（hiv）、肝炎（hbv）、猪内源性逆转率病毒（perv）等病毒的复制，在对肝脏疾病和自然免疫反应中发挥重要作用。有研究结果表明APOBEC3F基因的抗逆转录病毒特性具有普遍性1材料和方法1.1猪目的组织制备试验猪包括9个品种,共193头,其中杜洛克猪36头(购自杭州大关猪场)、长白猪42头(购自杭州大关猪场)、大白猪38头(购自杭州大关猪场)、苏钟猪34头(购自江苏省农业科学院动物科学基地猪场)、姜曲海猪14头(购自江苏姜曲海猪场)、定远猪12头(购自安徽定远县猪场)、二花脸猪5头(购自江苏省常熟市畜禽良种有限责任公司)、梅山猪5头(购自江苏太仓市种猪场)、三元杂交猪7头(购自镇江丹徒区云立牧业有限公司)。每个个体取耳组织于冻存管中,置于液氮中保存。PRRSVNJGC株由江苏省农科院兽医研究所提供。1.2方法1.2.1温度复性法耳组织样的DNA提取采用酚/氯仿抽提法,TEbuffer溶解后,-20℃保存。PCR反应程序:98℃变性10s;各引物最适温度复性5s,72℃延伸1min20s,35个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,检测扩增结果。1.2.3pcr扩增及测序每6头猪DNA等量混合构建DNA池,构建3个不同的DNA池,进行PCR扩增,电泳纯化后的PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。1.2.4pcr产物的酶切分型根据测序结果选择外显子8的5bp处的多态位点,建立PCR-RFLP检测方法,引物Nrul-SNP序列见表1。PCR反应总体系20.0μl,含模板DNA60ng,Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl,dNTPs(10mmol/L)0.4μl,上、下游引物(10μmol/L)各0.6μl,MgCl用Nrul酶对引物Nrul-SNP扩增的PCR产物进行酶切分型。酶切反应体系为16.0μl:含PCR产物5.0μl,Nrul(10U/μl)0.5μl,10×Tbuffer1.0μl,灭菌蒸馏水9.5μl,37℃反应4h。2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,EB染色,培清JS-780全自动凝胶成像分析仪进行拍照分析。1.2.5prrsv易感率测定参照Ait-Ali等1.2.6数据分析不同猪种群体不同基因型的PRRSV易感性数据分别用SPSS17.0软件的OneWayANOVA进行关联分析。2结果与分析2.1bec3f基因检测对猪APOBEC3F基因内含子3进行PCR扩增,在1000~2000bp间出现1条特异性条带(图1)与预期结果一致。对猪APOBEC3F基因外显子8进行PCR扩增,在1000~2000bp间出现1条特异性条带(图2)与预期结果一致。测序结果显示,在内含子3的16bp处出现1个A/G突变(图3)。在外显子8的5bp处出现1个G/A突变(图4)。经分析外显子8的5bp处出现G/A突变处于Nrul酶切位点内,而内含子3的16bp处A/G突变引物不易设计,即使用人为创造酶切位点的方法也不能找到合适的限制性内切酶。2.2pcr扩增产物的表达针对外显子8的5bp处G/A的单碱基突变设计特异性引物,命名为Nrul-SNP。对猪DNA进行PCR扩增,在500bp与750bp之间得到1条特异性条带(图5),与预期结果一致。用限制性内切酶Nrul对引物Nrul-SNP扩增的PCR产物进行酶切分型,以PCR产物作为对照电泳,AA型为1个572bp片段;GG型为379bp和193bp2个片段;GA型为572bp、379bp和193bp3个片段(图6)。2.3基因特征的apobec3f2.3.1猪群体中基因型的检测在各猪种群体中外显子8的5bp处可以检测到3种基因型,以GG型居多,GA型次之,AA最少;定远猪和梅山猪群体中检测到3种基因型;二花脸猪群体中检测到GG和GA2种基因型;其他猪群体只检测到GG1种基因型。在所有被检测猪种群体中,G等位基因的频率均高于A等位基因,因此G为优势等位基因(表2)。2.3.2定远猪、植物和二花脸猪群体的选择潜力外显子8的5bp处在定远猪、梅山猪和二花脸猪群体中为中度多态(0.25<PIC<0.50),而在其他群体中未表现出多态性,表明该多态位点在定远猪、梅山猪和二花脸猪群体中存在较强的选择潜力(表2)。采用χ2.4prrsv考数比较APOBEC3F基因外显子8的5bp处不同基因型猪肺泡巨噬细胞(PAM)接毒后PRRSV拷贝数(表3)发现,AA基因型猪PAM细胞接毒后12hPRRSV拷贝数显著高于GG型(P<0.05),极显著高于GA基因型(P<0.01)。3pam细胞接毒前后prrsv的易感性大量研究结果表明APOBEC3F基因具有抑制HIV比较外显子8的5bp处不同基因型猪PAM细胞接毒后PRRSV拷贝数发现,AA型猪PAM细胞接毒后12hPRRSV拷贝数显著高于GG基因型(P<0.05),极显著高于GA基因型。表明AA型猪PRRSV易感性高于GG型和GA型,提示G等位基因更有利于抵抗PRRSV的感染。通过数据库查询对比可以得出,本研究检测到外显子8的5bp处G/A突变是有义突变,导致APOBEC3F基因所编码蛋白质的第391位的丙氨酸(Ala)变成苏氨酸(Thr)。有研究结果1.2.