检验科微生物室课件

临床微生物质量控制内容二、临床微生物的质量控制三、实验前质量控制四、实验中质量控制五、实验后质量控制六、工作中常见的问题和解决方法七、目标一、临床微生物实验室的重要性一、临床微生物实验室的重要性人类面临着微生物的挑战，要打赢这场战争不仅需要有经验的医生，还需要一支优秀的临床微生物检验队伍。与过去的10年或20年相比，临床微生物实验室的规模和发展速度已经发生了巨大的变化。目前，我们离CLSI(临床实验室标准化协会)标准化文件要求还相差很远，我们应进行规范操作，才可能应对微生物向人类的挑战，才能适应临床的需要。临床微生物检验，在感染性疾病及相关病患的诊断治疗预防及研究工作中起着越来越重要的作用，为了保障检验结果的准确性和可靠性，日常工作中要注意开展质量控制。临床微生物检验的目的和意义提供感染性疾病诊断的病原学依据为医院感染流行病学调查提供依据为感染性疾病治疗提供用药依据细菌耐药性监测需要为合理使用抗菌药物提供依据为生物安全、医院感染管理和监控预防提供科学依据为了保证检验结果准确无误，应对室间质评和室内质控实行全面质量管理。临床微生物检验是对人体的各种物质进行微生物学检验，整个检验过程包括病人样品的采集、运送、处理，样品中致病微生物的分离、培养、鉴定，药物敏感试验，出具检验报告。其质量控制环节多、涉及的知识面广、复杂性高、需要超强的责任心。二、临床微生物的质量控制临床微生物检验质量控制的有关概念为了保证质量控制，首先应了解以下有关概念：细菌检验的质量：结果真实显示标本中存在的病原菌及其生化特征和抗药性细菌检验的质量控制：制定细菌检验的质量水平，并采取监测手段，这一过程称为细菌检验的质量控制。质量保证：为达到应有的质量水平而采取的措施。质量评价：用一个客观的公认的标准来评定一个实验室或实验室中某项试验是否达到标准的过程。室间质量控制：是各地实验室之间进行质量控制的一种方式，也是上一级实验室对各实验室进行质量管理的手段。参加由省临床检验中心或卫生部临床检验中心组织的室间质控，会遇见一些平时罕见或未见过的菌株，通过质控检验对它们的生长条件、菌落形态、染色、镜下形态等有了较深的感性认识。日后工作中倘若再遇见这些菌将不再会漏检。室内质量控制：做好室内质控直接关系到日常检验工作的质量。室内质控主要包括几个方面：实验室前的质量控制、标本接种前的质量控制、培养基的质量控制、试剂质量控制、常用仪器的质量控制、药敏实验的质量控制、及发报告前的质量控制。分析后质量控制范畴分析前分析中质量保持持续改进

临床微生物质量控制的依据标准卫生部医政司颁布的《全国临床检验操作规程》，美国临床实验标准化协会（CLSI）定期颁布的最新的质量控制和评议方案。检验方法学、操作手册应不断更新，开展循诊医学，不断淘汰无价值的试验，增加新的有临床价值的试验。微生物实验室程序临床微生物制度生物安全防护制度三级报告制度：①涂片；②初步药敏和确切涂片；③正式鉴定和药敏传染病原报告制度菌毒株保存制度废弃物处理制度质量控制制度制定程序性文件（可参考ISO15189认可准则中应用说明要求）SOP操作手册仪器的性能验证等为了保证质量控制，我们需注意：标本的质量（数量、体积、可接受的合格标本、运送方式等）试验方法的有效性（根据临床症状、诊断和其他临床资料，采用适当检测方法）试验的操作方法和步骤、试剂、培养基、仪器、环境、人员等。有临床意义的结果报告（报告的及时、准确、完整）临床微生物实验室的基本装备孵育箱、CO2培养箱、高压灭菌器生物安全柜试剂、染液、质控菌株、培养基冰箱、酒精灯、接种环、游标卡尺、温度计等光学显微镜室内质控室内质控内容包括对各种实验条件及实验过程进行监督监督的对象有仪器设备、培养基、鉴定系统等操作全过程室间质评临床微生物室需建立室内质控

11234常规试验室内质控培养基质控药敏试验的质控自动化设备质控：鉴定和药敏、血培养系统ATCC：美国典型菌株保存中心-主要来源NCTC：英国国家典型菌株保存中实验中用标准方法鉴定，鉴定值>95％典型菌株，并经多次传代，特征衡定的菌株质控菌株

参考菌株临床分离菌质控必备菌株细菌名称菌号用途金黄色葡萄球菌ATCC25923纸片扩散质控金黄色葡萄球菌ATCC29213MIC测定质控大肠杆菌ATCC25922纸片和MIC绿脓假单胞菌ATCC27853纸片和MIC粪肠球菌ATCC29212胸腺嘧啶含量测定淋病奈瑟菌ATCC49226淋球菌药敏流感嗜血杆菌ATCC49247嗜血杆菌药敏肺炎克雷伯菌ATCC700603ESBL阳性菌低温速冻苛养细菌冷冻干燥长期保留菌株参考菌株保存方法高层琼脂非苛养菌琼脂斜面现用菌株参考菌株保存方法室间质评—样本的检测操作程序1.测试环境、仪器、试剂的要求室温：20～25℃湿度：<80%试剂：所用试剂或试条均为仪器配套产品质控品：为仪器配套产品，并在使用效期内，同时无变质或污染。仪器：仪器必须有质量控制保证。2.质评样品的准备按测定日期从冰箱中取出参评物，放置至室温(约30min)。根据标本种类，质控菌株进行培养分离鉴定。3.质评样品的测定质控菌株用小牛血清或肉汤溶解，按标本种类接种各种选择培养基，放适当环境培养。培养分离病原菌，根据病原菌种类进行鉴定和耐药表型检测，并根据质控要求，病原菌进行药敏试验(重复2次)。4.填写报表或网上回报填写报表时应按要求逐项填写，字迹清晰整洁。填写完后再次核对，以防笔误、样本号顺序错误等。然后则测定者、室负责人签字。5.结果存档填写完后复印或将网页另存，一份寄出，一份存档，以备核查。室间质评的评价方法1.单项PT值评分标准每一批号每一项目结果在允许范围内时，测定结果合格，得分为100%，若在允许范围外时，测定结果不合格，得分为0%。单个项目的得分计算公式为：(该项目的合格结果数÷该项目的总的测定样本数)×100%。合格：该项目的测定成绩≥80%

不合格：该项目的测定成绩≤80%2.总项目的PT值评分标准总项目的计算公式为：

(总项目的合格结果数÷总项目的总的测定样本数)×100%

合格：总项目的测定总分≥80%

不合格：总项目的测定总分≤80%3.部临检中心给参加实验室发证书的规定合格证书：每年每个专业参加2次或3次以上，不得缺席，每次有五个调查样本。每次总项目的测定总分≥80%；颁发合格证书。参加证书：不符合合格证书的要求和标准的均颁发参加证书。注意：若失控，应将调查所有失控原因及相关纠正措施，并做好记录，上报科质量控制小组和科主任，由科主任签字后，质控结果归档保存。1.患者的准备2.标本采集3.标本保存与送检4.验收和登记5.标本的正确评估

三、实验室前的质量控制1.患者的准备①精神因素：紧张、情绪激动可影响神经内分泌功能，致使白细胞、血糖、乳酸、非酯化脂肪酸升高，在采集血液标本前医生或护士应向患者解释采集标本的目的、方法及注意事项，让患者克服紧张情绪。②饮食：某些血液成分受饮食影响较大，护士在标本采集前要告诉患者明确的禁食时间及禁食内容，以避免饮食因素影响检验结果的准确性。如血脂检测至少两周内保持一般饮食，患者应在采血前24h禁食高脂肪饮食，12h禁食空腹采血，且前1d晚禁止大量饮酒。③运动：强烈的肌肉运动明显影响体内代谢，丙酮酸、乳酸可升高，对红细胞、白细胞、血红蛋白的测定明显影响，可造成假性升高。住院患者可在起床前抽血，匆忙起床到门诊的患者应至少休息15min后采血。④药物：药物对血液成分的影响是一个十分复杂的问题。采集标本应尽量选择在未使用各种药物前。如患者长期服用药物，在选择与解释结果时，必须考虑药物的影响。

2.标本采集----标本的质量控制采集原则：捕捉病原菌并保存其活性，以提高检出率，尽可能避免非病原菌的污染和干扰。标本采前集的准备：向临床提供标本采集手册，对收集和运送标本的容器控制，无菌、不易碎、足够大，避免用木质的棉拭子（由于棉中所含的脂肪酸以及从木棒中渗出的树脂和甲醛对细菌有抑制作用）对细菌有毒害。3.正确的运送和保存方式需进行细菌学检测的所有标本，最好在收集后2h内送到实验室。量少标本在采集后15-30分钟内送检。对环境敏感的细菌包括志贺氏菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌（对低温敏感）等均应立即处理。通常用于细菌学检验的标本在4°C存放不超过24h，而病毒检测标本可于4°C存放2-3天。4.标本验收仔细核对，标本标识是否与申请单一致和唯一，对不合格标本要拒收。标本拒收的原则错误标签标本泄露，标本明显被污染拭子上的标签干掉或者标本量不够标本不适合所要求的试验运送标本的时间过长或所用运送培养基不合适5.标本评估—有可靠的标本质量评价方法痰标本中>10个上皮细胞/LP、<25个WBC/LP为不合格标本有培养价值的粪便标本：涂片镜检WBC>5个/HP，未经抗菌药物治疗的持续性腹泻患者粪便伤口标本：如出现上皮细胞，提示标本已受皮肤菌群的污染，高倍视野中超过5个鳞状上皮细胞的伤口标本不适合做厌氧培养血液细菌培养临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血流感染的患者，需做血液细菌培养以明确病原。及时、准确地从患者血液中分离出病原菌，才能正确实施有效地抗菌治疗，从而有助于提高治愈率和降低医疗费用。

1.采血时机应在用抗菌素治疗前,最好在患者发冷发热前半小时采血为宜。2.采血次数与间隔急性感染患者：从两臂分别采2份血样（两套）。感染性心内膜炎患者：24h内采血3次,每次间隔不少于30分钟。发热原因不明患者：24～48h后可再采血2次,间隔不少于60分钟。血液细菌培养3.血培养采血方法、量、消毒与送检采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。采血量-最重要血液和瓶中液体的比例应为1:10，成人8～10ml、小儿2～5ml；血量不足-先需氧瓶，剩余血接种厌氧瓶。为防止污染正确的皮肤消毒特别重要！按照规范执行。亚急性感染性心内膜炎、人工瓣膜：主要病原菌是皮肤正常菌群，应自静脉，而不是留置导管内采血。标本立即送检，否则室温放置。呼吸道标本细菌培养----痰采集方法自然咳痰：必须用清水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器中或输送培养基中；支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基处理痰首先用灭菌生理盐水将痰液洗3次，然后将痰块打碎，或加入等量10g/L的胰蛋白酶将痰块消化后再接种。合格标本

外观为脓痰、粘液、血，涂片镜检<10个上皮细胞/LP、>25个WBC/LP为合格标本。呼吸道标本细菌培养标本留取质量的好坏直接影响到对呼吸道病原学的诊断标本的采集要尽量减少上呼吸道正常菌群干扰应在用药前或停药1天后留取标本。泌尿道标本细菌培养应在用药前或停药5天后留取标本,并使尿液在膀胱内停留6～8h以上。尽量避免或减少尿道口正常菌群干扰。清洁中段尿、导尿导管尿、经耻骨上皮肤穿刺采集膀胱内尿液，送检标本以晨起第一次尿液为佳尿量不宜太多，试管塞子与尿液不应直接接触留取导尿管尿要排空导尿管内陈旧尿液，倘留置尿管超过三天应避免采用。标本采集后立即送检，不能立即送检者，可暂存4℃冰箱，但保存不超过8h粪便标本的培养应在发病早期并且尽量在用抗生素治疗前采集，稀便不少于1ml，固体便不少于1克，无便患者可用直肠拭子采集标本。要挑取含脓、黏液、血等病理改变或水样粪便送检。直肠拭子采样量要足够，拭子上肉眼应可见粪便。注意事项：⑴虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。⑵厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。⑶注意挑取脓血便或粘液便做培养⑷要进行分区划线。如图所示。分泌物的培养1.对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。2.闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。脓液标本要尽量避免病灶表面细菌污染。开放性脓肿，采样前无菌盐水冲洗伤口，拭去表面污染脓液，挑取病灶深部脓液；封闭性脓液，严格病灶皮肤或黏膜表面的消毒后用无菌干燥注射器穿刺抽取，置无菌试管内送检，或切开排脓时用无菌拭子采集深部脓液。厌氧菌和伤口标本厌氧菌标本隔绝空气-氧对厌氧菌有毒性作用液状标本应用注射器抽取密封送检分泌物标本最好床边采集床边接种；另置厌氧环境送检（输送培养基）伤口标本在伤口切开排脓时留取标本不能在伤口消毒清洗后留取标本尽量采集伤口深部的脓汁送检脑脊液标本直接涂片：革兰染色、抗酸染色、印度墨汁染色无菌采集技术：避免标本污染及患者被感染病毒培养标本：置4℃保存分枝杆菌培养标本：2mL以上，置4℃保存细菌培养标本置35℃保存种类和环节多（细菌鉴定、药敏、培养基、生化管、仪器、稀释液）涉及知识面广复杂性高需要强烈的责任感四、微生物试验分析中质量控制常规试验的质量控制-天天做（质控菌株）触酶试验：3％H2O2每三天更换一次血浆凝固酶试验：人血浆或商品乳胶试剂氧化酶试验：1％盐酸四甲基对苯胺水溶液浸泡厚滤纸，室温吹干压成小纸片，置含干燥剂容器－20℃保存，或买商品制剂β－内酰胺酶：头孢硝噻吩(Nitrocefin)为底物，适于测试嗜血杆菌、淋球菌、卡他莫拉菌、肠球菌革兰染色：革兰阳性菌染成紫色；革兰阴性菌染成红色；另涂片厚度、染色和脱色时间、染料沉渣等也影响染色质量抗菌药物敏感性试验-常用方法扩散试验diffusiontest：纸片扩散法(抑菌圈直径)稀释试验dilutiontest：肉汤稀释法、琼脂稀释法、最小抑菌浓度minimuminhibitoryconcentration，MICE试验E-test自动化仪器检测

纸片扩散法操作步骤制备接种物（0.5麦氏单位）M-H琼脂平板上（15分钟内接种，涂抹均匀）在接种好的琼脂平板上贴加纸片

孵育（15分钟内反转平板，35°C空气孵育）

苛养菌5％CO2孵育判度结果和解释结果ESBL确认试验ESBL的质控频率筛选试验和表型确证试验均可每日进行或每周进行，所选择菌株为肺克700603或大肠埃希菌25922。应该注意的是：肺克700603ESBL基因在质粒上，应将其冻存于-60℃或以下。奇异变形杆菌ESBL监测试验不适用不适用Ceftriaxone>127Cefotaxime

NANAAztreonam>122Ceftazidime>1*22*Cefpodoxime稀释法

(µg/ml)纸片扩散法(mm)Drug可诱导的克林霉素耐药(erm-介导)常规D－试验:阳性

15g红霉素纸片及2g克林霉素之间距离为15-26.“DTest”–阳性反应

纸片扩散法判读结果将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC法确变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏忽略薄纱样蔓延生长，微弱生长（20%或更少），克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄雾状菌苔应报告细菌对克林霉素耐药,不管其是否显示“D”抑菌圈五、实验后质量控制药敏结果结果的审核S-敏感（Susceptible）：用常规用量治疗有效，常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC5倍以上。R-耐药（Resistance）：用常规用量治疗不能抑制细菌的生长，MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度。I-中介(Intermediate)：MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株，药物生理浓集部位有效(泌尿道)，加大用药剂量可能有效。常见细菌的耐药问题肺炎链球菌—PRSP肠球菌—VRE葡萄球菌—MRSA、VRSA肠杆菌属—AmpC超级细菌—NDM-1（Ⅰ型新德里金属－β－内酰胺酶）以上的耐药问题都为目前全球最关注的细菌耐药问题，也是我们在工作中要特别注意的问题

临床微生物实验室报告制度的规范临床微生物实验室应对不同的细菌检验报告时间和内容应有相应的规定，并告诉临床各科，依此可防止不明原因的报告延迟。应分两种报告形式：危重感染报告:常规报告:报告的规范化1.涂片报告革兰染色：危重报告30－60分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。常规报告24h,危重报告1h－2ｈ。2.血液和无菌体液培养的报告制度实行三级报告制度：第一级：培养液直接涂片结果；第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果；第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。报告的规范化3.便培养24小时可发出初始报告;72小时应报告药敏试验结果；根据检测范围报告检测结果，如未检测出沙门菌、志贺菌。错误报告:未见到致病菌4.尿培养：可在24小时报告初始结果，包括菌落计数和可能细菌种类，如氧化酶阴性的革兰阴性杆菌；金黄色葡萄球菌等。

5.痰培养：24小时初始报告，报告内容包括痰标本是否合格，优势细菌，金葡菌、铜绿假单孢菌等特征明显细菌的鉴定结果。6.分泌物报告：24h初始报告，有无细菌生长；革兰阳性或阴性细菌或特征明显的细菌名称；根据涂片结果推测致病菌。临床微生物检验常见问题及解决方法标本合格率低—制定标本采集、运送、评估及处理手册，并进行宣传培训等苛养菌分离率低—培养基质量、培养环境及人员水平结果准确性不高—操作规范化及检验前、中、后质量保证质量控制中存在的问题—制度执行细菌耐药性监测工作还不能适应抗感染治疗需要—快速、准确的病原学报告及药敏试验结果使用CLSI标准不规范可能造成的错误—依据CLSI选药，结合本院用药细菌检验基础知识不扎实可能出现的问题—人员基本功提高、学习、培训七、工作中常见的问题和解决方法常见报告结果与临床期待结果不一致的情况临床认为有细菌感染而培养阴性药敏结果与临床治疗不符培养的细菌认为是污染菌结果耐药而治疗却有效结果敏感而治疗效果不佳有关细菌耐药我们应该知道什么？

天然耐药的抗菌药物（肯定无效）可选择的抗菌药物（可能有效）细菌药敏试验可以提供哪些信念如何解读细菌药敏试验结果解读药敏结果注意事项药敏试验是参照美国的CLSI推荐的标准制定的细菌全自动分析仪的药敏组合是固定的某些细菌对某些抗生素天然耐药，则不需要做药敏试验的药物代表一类药，而不是一种药解读药敏结果注意事项对葡萄球菌一代头孢比三代头孢治疗效果好有些药物不适用单独使用，仅用于联合用药，如利福平因为是体外药敏试验，有些药体外敏感，可能临床治疗无效同一株可能出现亚种，导致连续药敏结果吻合药敏试验可以