第五章分子标记辅助育种课件

分子标记辅助育种标记辅助育种（Markerassistedselection)是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。

遗传标记(geneticmarkers)是基因型的特殊的易于识别的表现形式。第一节遗传标记发展理想的遗传标记主要应具备以下标准:(1)具有较强的多态性;(2)表现为共显性(codominance);(3)选择中性，对主要的农艺性状没有影响;(4)容易操作．自动化程度高。5)重复性好；6)所得数据可在实验室之间交流和比较。多态性或遗传多态现象(GeneticPolymorphism)是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或两种以上不连续的变异型或基因型，每种类型的比例较高,不能由重复突变来维持。遗传标记主要有四种类型:形态标记（morphologicalmarker）细胞标记（cytologicalmarkers）生化标记（Biochemicalmarker）同工酶:酯酶和过氧化物酶贮藏蛋白分子标记（molecularmarker）分子标记的优越性：直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性。SinglebasemutationInsertion/deletionRearrangementBasedonvariationintheDNAsequenceMolecularMarkerCAPACITY1985199019952000DNAChipsISSRAFLPsSSRsRAPDsRFLPs????AdvancedinMolecularMarkers第二节分子标记技术

几种常用的分子标记技术基于Southern杂交的分子标记基于PCR技术的分子标记

一、基于Southern杂交的分子标记限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）1RFLP标记RFLP标记的原理

植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。

RFLP标记的特点

（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中二、基于PCR技术的分子标记随机扩增片段长度多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）特异性扩增子多态性（SpecificAmplificonPolymorphism，SAP）

简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR）扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）1RAPDsAnonymousmarkers-butcanbeconvertedtoSCARsDominantmarkers-homozygotescannotbedistinguishedfromheterozygotesFast,easyandcheap-commercialprimersetsavailablePCR-basedmarkers2SSRmarker简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR）或称微卫星DNA（MicrosatelliteRepeat）、简单串联重复序列（ShortTandemRepeatPolymorphism，STRP）。微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果

基本步骤设计探针，筛选重组克隆根据SSR两侧序列设计并合成引物

PCR扩增反应

建立基因组DNA的质粒文库对阳性克隆DNA插入序列测序凝胶电泳检测多态性Chromosome1,Region11(bin1.11)Thispagesummarizesthedataavailabledescribingfeaturesfoundinbin1.11inmaize.Whatisabin,andwhyisitimportant?

Thisregionishighlightedinredontheimageofmaizechromosomestotheright.

Youcanclickonregionsofthatimagetomovetootherportionsofthemaizegenome.GenesinBin1.11

OtherLociinBin1.11

Bin1.11High-DensityMapRegions

SequencesinBin1.11

ESTContigsinBin1.11

SSRsinBin1.11

BACsinBin1.11

Mappedlociw/accessionsinBin1.11

MapLocationsofSequencesinBin1.11

SSRsinBin1.11Herearethe38SSRsthathavebeenverifiedtobeinthischromosomalregion.(AC)20

p-umc1797(ACAA)4

p-umc1421(ACC)4

p-umc1500(ACC)5

p-umc1725(AG)10

p-umc1538(AG)6

p-umc1220(AG)8

p-umc1553(AGA)7

p-umc1737(ATGGG)4

p-umc1630(CA)10

p-mmc0221(CA)14

p-mmc0031(CA)15

p-mmc0011(CAAAA)4

p-umc1111(CCG)4

p-umc1681(CGT)5

p-umc2241(CT)8

p-umc1064(GA)8

p-umc1862(GAGCA)4

p-umc1118(GCGCCG)4

p-umc1744(GCT)4

p-umc2045(GGC)4

p-umc2244(GGT)10

p-umc1331(GT)7(GA)7

p-umc1009(TC)8

p-umc1129(TCTCC)4

p-umc2243(TGC)6

p-umc2242AAG

p-phi120ACC

p-phi227562AG(16)

p-bnlg2331AG(22)

p-bnlg1055AG(31)

p-bnlg2123AGG

p-phi265454ATCC

p-phi064p-(GATA)2(GACA)2p-bnlg131p-bnlg257p-bnlg504p-bnlg667

3AFLPmarker扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP），又称选择性限制片段扩增（SelectiveRestrictionFragmentAmplification）。双酶切连接节头预扩增选择性扩增ThespecificbandinXianyou63amplifiedwithAFLPprimercombinationE-AAC/M-CATCAP标记Indica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATJaponica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATIndica(51)TACTTGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGJaponica(51)TACTAGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGJaponica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTSBE1片段LeftprimerRightprimerSNP标记Indica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATJaponica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATIndica(51)TCCATGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGJaponica(51)TCCATcTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGJaponica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTSBE1片段LeftprimerRightprimerGCATPCR变性，退火GCATCELI变性走胶，检测

第三节分子标记在育种中的应用分子图谱的构建

品种、品系鉴定和杂交种纯度分析

亲缘关系分析基因标记及标记辅助育种（Marker-assistedSelection，MAS）

数量性状因位点（QTL）的分子标记辅助选择1分子图谱的构建主要包括以下步骤：根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体；群体中不同植株或品系的标记基因型分析；标记间的连锁关系。构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。用于分子标记的遗传作图可分为两类：暂时性分离群体，包括F2群体、BC等

永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等自花授粉作物作图群体的构建方法P1×P2F1F2F3F4F1B1:BC1F1×P1F1×P1F1×P1B2:BC2DHL异花授粉作物作图群体的构建方法ABCDEfGAbcdEfg×AbCDEfGaBCdefg杂合F1对B、D、G位点来说，相当于F2对A、C、E位点来说，相当于测交F位点不分离F2BC1DHRIL群体形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化个体F2个体自交后代性状研究对象个体个体品系品系准确度低低高高必要的群体规模大大中中分离比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作物群体的特点2品种、品系鉴定和杂种纯度分析

在国外，指纹图谱用来鉴定作物品种的DUS（Distinctness，Unformity，Stability），为品种审定、保存、保护提供依据。指纹图谱要求：分辨率高，多态性强；重复性好，稳定可靠。ThespecificbandinXianyou63amplifiedwithAFLPprimercombinationE-AAC/M-CAT123ComplementarypatternamplifiedwithAFLPprimerpairEcoRI-AAG/MseI-CAA.1.FemaleparentZhenxian97A;2.Shanyou63(Hybrid);3.MaleparentMinghui63.SSR检测杂交种郑单958纯度P1:父本；P2：母本；1-22：杂交种MP1P2123456789101112131415161718192021223亲缘关系分析DNA标记所检测的是作物基因组DNA水平的差异，因而非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间的比较可覆盖基因组，大大提高结果的可靠性。品种资源的鉴定与保存研究作物的起源与发展进化指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据。4基因标记及标记辅助育种标记目标性状的方法：近等基因系法（Near-isogenicLines，NILs）混合群体分组分析法（BulkedSegregantAnalysis，BSA）作物MAS育种须具备的条件

分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PCR技术。筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。进展水稻为例,已经定位的基因有以下几类:(1)抗病基因,如抗白叶枯病基因和抗稻瘟病基因;(2)抗虫基因,如抗稻瘿蚊基因和抗褐飞虱基因;(3)矮秆基因;(4)稻米品质相关基因;(5)育性相关基因,如光敏感雄性不育基因、育性恢复基因和广亲和基因等。白叶枯病抗性基因接近30个,21个为显性基因(Xa),9个为隐性基因(xa);13个表现全生育期抗性,15个为成熟期抗性,Xa21和Xa25(t)两个基因在分蘖后期表达抗性;已被定位的抗性基因有17个,克隆了5个基因。4基因标记及标记辅助育种MAS的主要应用有两个方面。有利基因的转育消除连锁累赘有利基因累加（聚合）

受体亲本×供体亲本

(不含优质基因)(含优质基因)F1×受体亲本BC1目标基因定位标记辅助选择

中选BC1×受体亲本

(含优质基因)BC2BC3标记辅助选择标记辅助选择中选BC3(含优质基因)

新育成的优质品种(受体亲本遗传本背景+优质基因)自交目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合程序图

中选BC1×受体亲本

(含优质基因)

受体亲本×供体亲本A(无优质基因)(含优质基因A)

受体亲本×供体亲本B(无优质基因)(含优质基因B)F1(含优质基因A)×F1(含优质基因B)复杂杂种(分离群体)

受体亲本×供体亲本C(无优质基因)(含优质基因C)

中选杂种个体×F1(含优质基因A和B)(含优质基因C)复杂杂种(分离群体)

中选杂种个体×受体亲本(含优质基因A、B和C)

新育成的优质品种

(受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C)回交1~2代，标记辅助选择自交标记辅助选择标记辅助选择标记辅助基因聚合与品质改良相结合程序图有利基因累加基因聚合(genepyramiding)就是将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中。基因聚合育种就是通过传统杂交、回交、复交技术将有利基因聚合到同一个基因组,在分离世代中通过分子标记选择含有多个目标基因的单株,从中再选出农艺性状优良的单株,实现有利基因的聚合。Satomi等用与抗性基因连锁的RFLP和RAPD标记聚合了Xa4+Xa5,Xa4+Xa10。Huang在聚合抗白叶枯病基因Xa4和Xa13后发现,聚合后的抗病性不仅具有亲本抗谱(抗小种1、5、6),而且还抗两亲本都感的生理小种4,且聚合材料的病斑长度大大短于任一亲本,这表明聚合基因可能会因为基因的互作或互补作用而可在抗谱和抗性水平上都有所加强。Huang等用RFLP和PCR标记对白叶枯病抗性基因累加系进行选择,成功地构建了含Xa4、Xa5、Xa13和Xa21的多基因累加系。中国水稻所利用回交和分子标记辅助选择相结合,育成了带广谱白叶枯病基因Xa21的两个水稻恢复系R8006和R1176,并配制出中优6号和中优1176[20]。5数量性状因位点（QTL）的分子标记辅助选择QTL是在高密度的遗传图谱基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmarker软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。QTL图位克隆的资源高密度区域特异的分子标记包括各种分子标记（ESTs、RFLP等），特别是基因组测序完成后提供了发展高密度分子标记最主要的来源；另一个是基因组大片段库（YAC、BAC、PAC）。

第四节存在问题及展望

存在问题：显性与选择效率基因型限制稳定性、可操作性1显性与选择效率显性标记不能区分纯合、杂合基因型相斥相（Repulsion－phase）的RAPD标记可提高选择效率。与菜豆普通花叶病毒抗性基因bc-3连锁相引标记-1选择纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占26.3%，72.5%和1.2%，用相斥标记-2选择分别占81.8%，18.2%和0。2基因型限制

最有价值的标记是在广泛的基因背景下都能表达，并能检测出来的标记。然而，目的基因与标记的连锁距离因遗传背景的不同而存在差异。标记与目的基因的遗传距离是影响辅助选择效率的一个重要因素。2基因型限制解决方法：寻找无重组的RAPD标记或将RAPD标记转化为RFLP标记3稳定性、可操作性RFLP操作繁琐、成本高RAPD稳定性差AFLP复杂、成本高转化为CAP或SCAR标记提莫菲维小麦G祖染色体特异性RAPD标记和SCAR标记二、展望决定因素：成本与效率转化为PCR标记多重PCR方法自动化操作简化检测技术分子设计育种Peleman和vanderVoort对“设计育种”(breedingbydesign)这一名词进行了商标注册。作物分子设计育种是以生物信息学为平台,以基因组学和蛋白组学的数据库为基础,综合作物育种学流程中的作物遗传、生理生化和生物统计等学科的有用信息,根据具体作物的育种目标和生长环境,先设计最佳方案,然后开展作物育种试验的分子育种方法。分子设计育种主要分三步进行:①定位所有相关农艺性状的QTL;②评价