酶学学生化笔记

酶学考试内容酶催化作用特点酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调整的生物催化剂。包括酶，核糖酶、脱氧核糖酶酶和一般催化剂的比较：共性：1.催化效率高、用量少〔细胞中含量低、2.不转变化学反响的平衡点 3.降低反响的活化能4.反响前后自身构造不变酶作为催化剂的特点：1PH条件下进展；2.酶具有很高的催化效率：酶催化可使反响速度提高108-1020倍，至少提升几个数量级；3.酶具有高度的专一性：酶对反响的底物和产物都具有高度的专一性，几乎没有副反响发生；4.酶的活性可收到调整和掌握；依据生物体的需要，很多酶的活性可受到多种调整机制的敏捷调整，包括别构调整、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。酶的作用机理1.酶活性部位酶的活性中心也称为活性部位，是指酶分子上与底物结合，并与催化作用直接相关的区域。假设酶是缀合酶后者参与催化，打算酶的催化力量。〔〕在酶分子的总体中只占相当小的局部〕酶分子大多数氨〔2〕活性中心是一个三维实体：通常由假设干一级构造上不相邻的氨基酸残基组成〔3〕活性中心并不是和构象同时发生了肯定的变化后才互补的和马上生成键的适当位置，这个动态的识别过程称为诱导契合〔4〕位于酶分子外表的一个裂缝内：中心多是疏水氨基酸，也有少量亲水氨基酸〔5〕底物通过次级键较弱的力结合到酶上〔6〕具有柔性或可运动性争论酶活性部位的方法：酶分子侧链基团的化学修饰，包括①非特异性共价修饰，某些化学试剂能和酶蛋白中发生转变，假设某基团修饰后，不引起酶活力的转变，则可能是非必需基团，反之，假设修②特异性共价修饰，某种化学试剂专一地修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使酶失活，如用二异丙基氟磷酸〔DFP〕测定出胰凝乳蛋白酶活性中心的丝氨酸残基；合成一些与底物构造相像的共价修饰TPETPCK乳蛋白酶的亲和试剂，与底物构造相像。TPCK与活性中心组氨酸结合后，酶失去活性，从而确定酶活性中心的组氨酸残基。动力学参数测定法PHPH能影响到活性中心侧链可解离基团的〔3〕X射线晶体构造分析法，可以分析酶分子的三维构造，有助于了解酶活性部位氨基酸残基所处的相对位置与实际状态，以及与活性部位有关的其他基团〔4〕定点诱变法，转变编码蛋白质基因中的DNA挨次，争论酶活性部位的必需氨基酸。酶的专一性确定专一性：是指一种酶仅催化一个特定的反响，对底物有严格的要求。相对专一性：在生物体内，大多酶具有的专一性是相对专一性，包括基团专一性和键专一性。前者是指一种酶只作用于含特定官能团〔如磷酸基团，氨基，甲基等〕的分子，如磷酸酶只水解特定底物分子上的磷酸基团。后者是指一种酶只作用含有特定化学键的分子，两个氨基酸是哪一种。立体专一性。可分为旋光异构专一性和几何异构专性旋光异构专一性酶只作用其中的一种。如L氨基酸氧化酶只能催化L氨基酸的氧化，对D型氨基酸无作用。几何异构专一性酶只能催化琥珀酸生成延胡索酸，不能生成顺丁烯二酸。有三个模型可以解释酶作用的专一性：1.锁和钥匙假说；2.诱导契合假说3.“三点附着”假说“锁和钥匙”模型：该模型认为活性中心的构象是固定不变的，底物的构造必需与它的构造格外吻合才能结合，即酶和底物是锁和钥匙的关系，局限是不能解释酶的逆反响。“诱导契合”模型：酶活性中心不是僵硬不变的构造，而是具有肯定的柔性。酶与底物导就开头了。这种诱导是双向的，一方面受到底物分子的诱导，其构象发生变化是契合。“三点附着”模型：对于酶为什么能够区分一对对映异构体，或者一个假手性C上两个一样的基团，需要酶与底物的“三点附着”模型来解释。该模型认为，底物在活性中心的结合3个结合点都匹配的时候，酶才会催化相应的反响。酶催化反响的独特性质〔〕酶反响可分为两类，一类反响仅仅涉及到电子的转移，另一类反响涉及到电子和质子两者或其他基团的转移〔2〕酶的催化作用是由氨基酸侧链上的〔3〕最适pH〔4〕活性部位通常只比底物大一点底物和酶的邻近效应和定向效应：邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的提定向效应是指反响物的反响基团之间和酶的催化基团与底物的反响基团之间的正确取位产生的效应。底物形变与诱导契合：当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反响的活化能，使反响易于发生。酸碱催化是通过瞬时地向反响物供给质子或从反响物承受质子以稳定过渡态，加速反响广义的酸碱催化：1.是酶分子上的酸性和碱性基团催化反响；2缓冲溶液有助于通过供给或夺取质子来稳定过渡态溶液浓度。特定的酸碱催化：是H+或OH-加速反响2.催化效率与缓冲溶液无关，只取决PH。体内的酶反响以广义的酸碱催化为主。总酸碱的解离常数酸或碱的强度〔pK值〕及质子传递的速率。共价催化在催化时应加速。金属离子催化-金〔Fe2Fe3Cu2Zn2Mn2+、Co3+〕和〔NaK+、。金属离子以下5种主要途径参与催化过程：1.通过结合底物为反响定向2.通过可逆地转变金属离子的氧化态调整氧化复原反响、3.通过静电稳定或屏蔽负电荷、4.作为路易斯酸承受电子，使亲核基团或亲核分子〔如水分子〕的亲核性更强。5.本身是酶构造的一局部活性中心的微环境电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反响速率。影响酶促反响的因素〔米氏方程的推导〕一、属于外因的包括:反响温度反响介质的pH、离子强度以及有无抑制剂或激活剂的存在等1．温度对酶促反响速率的影响温度对酶促反响速率的影响表现在两个方面：一方面是在肯定的温度范围内,酶促反响与大多数化学反响相像,反响速率也会随着温度的上升而加快，由于温度上升会提高分子之间的碰撞时机,而且还可以让更多的底物分子获得能量到达过渡态。温度对酶促反响的影响程度可用温度系数(Q10Q10是指温度每上升10℃度每上升10℃酶促反响速率为原反响速率的2倍。另一方面，由于酶主要是蛋白质，即使变性，酶活性会急剧下降。因此在温度较低时，温V型曲线，在此曲线定点所代表的温度下，酶活性最高，这时的温度称为最适温度。的温度，但是假设延长反响时间，最适温度降低。PH对酶反响的影响酶的活力受环境PH的影响，在肯定的PH下，酶表现出最大活力，高于或低于此PH，酶活力降低，通常把表现出最大活力的PHPH。H对酶的影响可能有以下几个方面〔〕过酸或过碱可以使酶空间构造破坏，引起酶构象〔2〕当PHPH可能影响了底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物；PH影响响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物〔3〕PH影响维持酶分子空间构造有关基团的解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。最适PH不是常数，它受底物浓度，缓冲液种类及浓度以及酶的纯度的影响。PH影响反响速率Mg2+，Cl-作为一些酶的辅因子也影响反响速率。激活剂对酶反响的影响：但凡能提高酶活性的物质都称为激活剂，其中大局部是无机离子或简洁的有机化合物，激活剂对酶的作用有肯定的选择性。抑制剂对酶反响的影响抑制作用的类型：不行逆的抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复性可逆的抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活。可逆抑制分为三种类型：〔I〕〔S〕参加竞争性抑制剂后，Vmax不变，Km变大，K’m＞Km，而且K’m随【I】增加而增大，双倒数作图直线相交于纵轴。抑制程度取决于底物浓度和抑制剂的相对浓度。常见的竞争性抑制剂：1.丙二酸或戊二酸是琥珀酸〔丁二酸〕的类似物，能够竞争性抑制琥的类似物，PABA〔如二氢叶酸合成酶〕的活性，从而阻挡PABA作为原料3.有时候细胞内一些限速酶催化反响产生的产物在构造上与底物相像，于是这些产物在过量的时候，6磷酸葡萄糖脱氢NADPH为产物，因此酶活力降低，不能用增加底物浓度来解除抑制。参加非竞争性抑制剂后，Km值不变而Vmax变小，K’m=Km，而且V’max随【I】增加而减小，双倒数作图直线相交于横轴。③反竞争性抑制：酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。参加反竞争性抑制剂后，Km及Vmax都变小，K’m＜Km，V’max＜Vmax，即表观Km及表观Vmax都随【I】增加而减小，双倒数作图为一组平行线。KmESEIS种结合消耗ES，从而削减了ES的浓度，这相当于把酶与底物结合反响的平衡拉向右边，即有利于酶和底物的结合，从而导致酶与底物的亲和力增加，即表观Km种酶活性部位的必需基团而导致酶的失活。非专一性不行逆抑制剂主要有：①有机磷化合物，常见的有DFP，与酶分子活性部位为神经毒剂；解磷定和氯磷定能够把酶上的磷酸基除去，使酶复活。②有机汞、有机砷化合物，与酶分子中半胱氨酸的巯基作用，抑制含巯基的酶，如对氯汞苯甲酸〔PCMB〕这类使酶变性，低浓度抑制酶活性。一般可以用金属螯合剂如EDTA、半胱氨酸等去除；④烷化试剂：如碘乙酸，DNFB。⑤氰化物、硫化物和CO：能与酶中的金属离子形成稳定的络合物，使酶失活。氰化物与含卟啉的酶〔细胞色素氧化酶〕中Fe2+结合；⑥青霉素：青霉素链交联。一旦该酶失活，细菌细胞壁合成受阻，细菌生长被损害。专一性不行逆抑制剂，分为KS型和kcat型：KS进展修饰标记的，故称为亲和标记试剂。这类抑制剂虽然主要攻击酶活性部位的必需基团，抑制剂与活性部位必需基团在反响前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位的同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值。例如胰蛋白酶要求催化底物具有一个带正电的侧链，Lys、Arg侧链。对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮〔TLCK〕和胰蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L赖氨酰甲酯〔TLME〕具有相像构造，因此前者可以与胰蛋白酶活性部位必需His57kcat型是依据酶的催化过程设计的，不但具有自然底物的类似构造，本身也是酶的底物，它拥有一个埋伏的反响基团并作用于酶的活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不行逆失活。二、影响反响速率的内因：属于内因的就是酶浓度和底物浓度酶浓度对酶促反响速率的影响关系。酶浓度的凹凸对酶促反响速率的影响是直接的。明显在不缺乏底物的条件下,酶浓度越大,反响速率就越快。假设底物缺乏,酶浓度再高,反响速率都会受到限制。因此,为了能真实地争论酶浓度对反响速率的影响,底物必需过量存在,以使反响速率不受底物浓度的限制。底物浓度米氏方程的成立需要满足3个条件:①反响速率为初速率。此时反响速率与酶浓度成正比关系，避开了反响产物以及其他因素的干扰;②酶底物复合物处于稳态(steady-state),即ES浓度不发生变化；3.反响符合质量作用定律,即反响速率与底物浓度成正比关系。米氏方程式〕依据酶反响中间复合物学说S S 则得出表示底物浓度与酶反响速率之间的定量关系的米式方程v= 〔9-11〕v为反响速率，Vmax为酶完全被底物饱和时的最大反响速率S】为底物浓度，Ks为ES的解离常数〔底物常数〕〔2〕1925 年提出了稳态理论对米式方程作出了重要的修正酶促反响应当分两步进展：第一步：酶与底物作用，形成酶-底物复合物：E+S ES其次步：ES复合物分解形成产物，释放出游离酶：ES P+E从米式方程〔9-23〕S】=Km，由此得到Km的物理意义：Km值是当酶反响速率到达最大反响速率一半时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数：Km米氏常数的意义：Km是酶的特性常数Km值随测定的底物、反响的温度、pH当k3≤k2，Km=k2/k1，即Km=Ks，因此在肯定条件下，可以用它来表示酶与底物亲和力的大小，一个酶的Km值越大，意味着该酶与底物的亲和力越低，反之，Km越小，该酶与底物的亲和力越高。假设某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度时，其反响速率相当于Vmax的百分率。Km值可以帮助推断某一代谢反响的方向和途径：丙酮酸在体内可被多种酶催化反响KmKm2.Vmax在特定的酶浓度下,Vmax也是一种酶的特征常数。然而,在现实的条件下,一个酶促反响很难v浓度发生变化,Vmax会随之发生转变。因此严格地说，一个酶促反响的Vmax只有在肯定的酶浓度下才是一个常数。对于大多数酶来说,反响速率随着底物浓度的上升而加快。实际上不管添加多少底物,酶反响速率从来不会停顿增长,只是增长的幅度越来越小。理论上只有当底物浓度到达无穷大的时Vmax从来不能被直接测定到,只能通过估算得到。在某些状况下,能得到的最大反响速率实际上远远低于真实的Vmax值,这可能是由于底物的溶解性不好,难以供给很高的底物浓度,也可能是某些酶的活性会被高浓度的底物抑制。3.Kcat3表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数通常称为催化常数t值越大，表示酶的催化效率越高。4.Kcat/Kmkcat/KmkcatKm。kcatKm,kcat/Km就越大。当[S]<<K.,即底物浓度很稀的时候，米氏方程可转变为v=〔kcat/Km〕[E][S],这时kcat/Km间反响的二级速率常数。该常数格外重要,由于它显示了在有足量酶的存在下,酶和底物能做什么,还允许直接比较酶对不同底物的催化效率。酶的提纯与活力鉴定的根本方法生疏酶的国际分类和命名抗体酶、核酶和固定化酶的根本概念和应用考试要求了解酶的概念了解酶的分别提纯根本方法酶包括有催化活性的蛋白质和RNA1.蛋白酶的提纯表示提纯过程中酶的损失状况，比活力的提高的倍数表示提纯方法的有效程度。选材：选择酶含量丰富的生物材料裂开抽提：在低温下以水或低盐缓冲溶液，从组织匀浆中抽提到酶，得到酶的粗提液温顺，全部操作条件一般在0-5摄氏度进展。用一系列分别蛋白质的方法来分别酶，用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分别，选择性热变性等方法可以从酶粗提取液中初步分别酶；再承受吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱等层析技术或电泳技术来进一步纯化酶，以得到纯的酶制品结晶溶液用饱和的硫酸铵溶液反透析后在浓盐溶液中保存。也可将酶溶液制成2550%的甘油分别贮存在-25℃或-50℃存酶的稀溶液。2.核酶的分别纯化核酶是具有催化功能的，因此其分别纯化过程要留意两个问题〕为确保A不被降解，操作需要在无RNA〔2〕为保证酶活力存在，需要在温顺条件下进展，防止过酸，过碱避开猛烈搅拌等。根本步骤：选择酶含量丰富的颖生物材料，裂开，抽提，分别和纯化等。生疏酶的国际分类〔第一、二级分类〔课本〕了解特别酶，如溶菌酶、丝氨酸蛋白酶催化反响机制把握酶活力概念、米氏方程以及酶活力的测定方法酶活力率来表示，两者呈性关系，酶促反响速率越大，酶活力越高，反之也成立，所以测定酶的活力就是测定酶促反响的速率。〔〔IU〕〔25°C〕1μmol底物转化为产物所需的酶量定为一个酶活力单位，即1U=1μmol/min。19721mol底物转化为产tlt单位与U单位之间的换算关系为：1Kat=60*106IU。酶的比活力代表酶的纯度，比活力用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。理或化学特性来打算具体酶促反响的的测定方法。常用方法有：1.分光光度法：利用产物和NADPH在340nm有光吸取2.荧光法：依据底物或产物的荧光的性质来测定，缺点是易受杂蛋白干扰，所以选择在可见光范围的荧光进展测定；3.同位素测定法：用放射性同位素标记底物，经酶作用后得4.电化学法：PH测定法。把握核酶和抗体酶的根本概念核酶：具有催化活性的RNA，按作用底物自然界有催化分子内反响〔如自我剪接和自我剪切〕〔P的RNA〕的核酶。核酶的觉察启发意义。上是一类具有催化力量的免疫球蛋白，在其可变区赐予酶的属性