特异性引物GSP对玉米丝黑穗病苗的检测效率获奖科研报告

特异性引物GSP对玉米丝黑穗病苗的检测效率获奖科研报告在对玉米进行某种病原检测中，通常使用的是PCR检测技术.PCR技术用来检测病原物是指选择某一特定的引物去扩增相应的目的DNA片段.该实验所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米丝黑穗病菌的特异性引物（GSP），然后采用PCR扩增检测技术可以对玉米病苗中的丝黑穗病菌基因组进行特异性的扩增，对扩增的样品DNA进行浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，最后在凝胶成像系统中进行观察和记录，从而得知玉米是否感染了丝黑穗病.最后计算出该特异性引物GSP对玉米病苗的检测效率，看是否可以用于快速有效的对玉米感病植株在发病之前对病菌进行检测.

1材料与方法

1.1材料准备

（1）丝黑穗冬孢子的观察

称取10mg已经处理好的玉米丝黑穗病菌冬孢子粉，将其置于1.5mL的离心管中，加入适量的无菌水浸泡过夜，然后置于高速离心机中离心2min（10000r/min），弃掉上清液.再用无菌水处理1d，再次离心并弃掉上清液.将已经处理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的2%葡萄糖溶液中，置于28℃的温箱中黑暗培养3d，3d后观察冬孢子的萌发状态.

（2）试验材料及病菌

玉米感病品种（黄早4），植物DNA提取试剂盒（宝生物公司购买），供试丝黑穗病菌（将事先收集好的病菌样品置于室内晾干，再用筛子充分筛选出孢子粉，将孢子粉置于通风、阴凉、干燥处保存备用）.

（3）配置菌土

土壤采样后放入高压灭菌锅中进行灭菌，待土壤冷却后加入玉米丝黑穗菌粉配置成1%的菌土.

（4）播种与接种

选取200粒感病品种黄早4，将种子在4月20日播种于吉林省农业科学院所属的玉米试验田（公主岭），每穴2～3粒，将配置好的菌土覆盖在玉米种子上.

（5）取样

在玉米抽穗前期（此时病状并未表现出来）对玉米的根与叶片组织进行采样.

1.2试验方法

1.2.1DNA的提取方法（采用试剂盒提取，提取方法参照说明书）

将采集的每份玉米根与叶片的样品取适量置于研钵中用液氮充分的研磨，将研磨好的样品组织（不多于50mg）分装于1.5mL的离心管中，并分别做好标记.加入400μLLEBuffer，上下颠倒混合均匀，迅速置于65℃环境中温浴15～30min（期间可震荡离心管2-3次），然后移出.

1.2.2DNA纯度的检测

随机抽取已提取的样品DNA进行电泳检测，每个随机样品取5μL于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电流180mA，电压180V，电泳15min，于凝胶成像系统中观察DNA的降解情况及是否有RNA的影响.

PCR检测：

（1）所使用的引物购买于上海生工生物公司，引物GSP的序列为上游5’-TCGCCGACGGATGATAATCG-3’下游5’-GAGTCACCCGCCCAAAGTTA-3’

（2）反应程序：共设置35个循环，步骤如下：94℃（预变性）4min→94℃（变性）1min→54℃（复性）1min→72℃（延伸）1.5min→72℃（延伸）5min→4℃环境中保存备用

（3）1.5%琼脂糖凝胶电泳用万分之一天平称取适量的琼脂糖，加入適量的已配置好的TAE溶液配制成1.5%凝胶，用微波炉将其沸腾一次后加入适量的EB，趁热倒入插好梳子的制胶槽中，待凝胶凝固后加入PCR的产物，10μL的样品，并加入DNAMarker.

（4）电泳的结果在凝胶成像系统中进行观察和记录.

2、结果与分析

2.1玉米丝黑穗冬孢子萌发情况的观察从温箱中取出已培养3d的玉米丝黑穗冬孢子，吸取适量的冬孢子滴于载玻片的中央，并滴几滴无菌水后盖上盖玻片，至于电子显微镜下观察其萌发状态.结果如下.冬孢子萌发前的状态，在将其至于2%的葡萄糖溶液中，28℃黑暗培养3d后，其萌发状态.说明该丝黑穗冬孢子粉具有活性且能正常萌发，可以使用其对玉米进行侵染.

2.2DNA的提取与检测

将采用试剂盒方法提取的DNA样品，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，用试剂盒所提取的样本组织的DNA可以获得高质量的DNA，可以用于后续的实验.

2.3PCR结果检测

2.3.1玉米叶片组织中丝黑穗病原菌的检测为带病玉米植株叶片组织DNA的电泳结果，其中M是DNAMarker，1～10，13～22均为黄早4未发病叶片组织DNA，11、23均为水（CK），12、24均为玉米丝黑穗病菌的DNA.根据图4可知，以玉米叶片DNA为模板进行病菌PCR检测发现只扩增出了3条与玉米丝黑穗病菌在同一范围内的谱带，其中5号较为明显，14号、21号均不明显，病菌的检测效率仅为15%.

2.3.2以玉米根组织中丝黑穗病原菌的检测为带病玉米植株根组织DNA的电泳结果，其中M是DNAMarker，1～10，13～22均为黄早4未发病根组织DNA，11、23为水（对照），12、24为玉米丝黑穗病菌的DNA.以玉米叶片DNA为模板进行病菌PCR检测发现扩增出了16条与玉米丝黑穗病菌在同一范围内的谱带，仅有2号、3号、5号没有扩增出谱带，13号不太明显，病菌的检测效率为80%.

在对玉米丝黑穗病进行PCR研究时，通常提取的是玉米下部组织的DNA而不采用玉米叶片组织的DNA.通过查阅相关的文献发现，玉米丝黑穗病属于幼苗期侵染的一种系统性的病害，丝黑穗的病原菌以散落在土壤中、混入到粪肥中或附着在玉米种子表面的冬孢子越冬，第二年成为主要的传染源，其中以土壤带菌侵染为主.病原菌于种子萌发开始从根茎、胚芽以及芽鞘侵染，并且在植株体内形成