微生物验证课件

时间反复无常，鼓着翅膀飞逝微生物验证微生物验证时间反复无常，鼓着翅膀飞逝微生物验证无菌、微生物限度检查及

方法验证要点

2菌种、培养基、实验室环境管理无菌检查及方法验证微生物限度检查及方法验证2010年版药典增修订情况

3菌种的分类三类：仅具一般性危险，能引起实验室感染的机会较少，一般的微生物学实验室采用一般实验技术能控制感染或有对其有效的免疫预防方法的菌种。四类：生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种及不属于上述一、二、三类的各种低致病性的微生物菌种。6微生物与生物安全实验室适用级别二级生物安全实验室（BSL-2）：登革热病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒等。脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、军团菌、白喉棒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、非典型结核分枝杆菌等。钩端螺旋体、致病性支原体、鹦鹉热衣原体、放线菌、青霉菌等。

7验证实验常用菌种枯草芽孢杆菌

[CMCC（B）63501]金黄色葡萄球菌

[CMCC（B）26003]生孢梭菌

[CMCC（B）64941]铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]大肠埃希菌[CMCC（B）44102]乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]白色念珠菌[CMCC（F）98001]黑曲霉[CMCC（F）9003]8细菌室消毒隔离措施1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒。2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡（至少24小时以上）后清洗或丢弃。5.所有微生物培养物（细菌、支原体、真菌等培养物），不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。9染菌物出试验时及试验后将染菌/带菌物品放于盛有0.1％的苯扎溴铵溶液的灭菌专用桶中浸泡。灭菌专用桶加盖，送集中洗涤室热压灭菌。将灭菌桶在121℃30min的条件下进行高压湿热灭菌，灭菌后再取出清洗。高压蒸汽灭菌效果验证10菌种保藏步骤①干燥菌种复苏，划平板②挑选特征典型的纯菌菌落；（制菌悬液使用）③确定保藏的合适菌体形态；④选择最适宜的保藏方法，定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。11琼脂斜面低温保存法（厂家常用）方法：将典型菌落接种在斜面（特殊菌种可用液体培养基）上，按规定培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2~3个月移种一次。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年~一年。适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。优点:简便，对大多数微生物都适用。缺点:保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。12冷冻真空干燥保藏法主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶形细致，不致损伤活菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。13试验用菌种的培养传代方法

（一）菌种的复苏（二）菌种的传代与保存（三）对照用菌液的制备检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。菌种的复苏在专用无菌室或超净工作台内进行。传代与保存:方法1：菌斜面,方法2：冻存管14传代：取菌液0.1ml接种至10ml液体培养基，按规定培养、稀释传代限制（5代）对照用菌种在使用过程中，亦应检查其生物学特性。如菌落形态、革兰染色、镜检菌体形态、主要生化特性。如发现染菌或变异，衰退等现象时，应及时处理。菌种分离15培养基管理

一般采用购自中国药品生物制品检定所合格的商品脱水培养基。同时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，按说明书规定灭菌使用。商品脱水培养基应在效期内使用，使用前应注意核对名称，检查外观，遇有接块、吸潮现象，应废弃。新鲜培养基的配制，应按质量标准规定的配方进行。对培养基的原材料要进行挑选，试剂应为化学纯试剂规格。制成的培养基要求无沉淀，必要时以适当方法过滤，调整pH值，分装灭菌备用。

16培养基性能的质量控制

无菌检查用需气厌气培养基的指示剂氧化层不得超过培养基深度的1/5，否则需经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。无菌检查结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1/2。大肠埃希菌检查用MUG培养基配制前应挑选无荧光的试管进行配制，观察结果时应用同批培养基配制的空白管和阳性菌管同时观察。对无菌培养基的无菌性、灵敏度检查17培养基的灵敏度检查:

（已知菌生长试验）①细菌组：取每管装量为12ml硫乙醇酸盐液体培养基9支，分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌试验菌各2支;空白对照：另一支不接种，温度培养24~72小时逐日观察结果②霉菌组：取每管装量为9ml的改良马丁液体培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支；空白对照：另一支不接种，培养5天。逐日观察结果。结果判定空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。18培养基管理配制好的培养基，按无菌要求进行灭菌。培养基的配制须有记录，记录内容含有：a）配制日期和配制人员的标识；b）培养基/溶液的类型、体积；c）成分、每个成分物质的含量、制造商、批号；d）pH（最初和最终）值；e）无菌措施，包括实施的方式、时间和温度。按日期编制灭菌后的培养基批号。将制备完毕的培养基按品种放置在阴凉的指定位置，备用。注意保存期。19a.湿热高压蒸汽灭菌法：依115℃121℃或132℃，应用于培养基灭菌、试验器械、工作服、橡胶物品灭菌和实验室废弃物，也可用于玻璃器皿的灭菌。一般121℃30min

因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。b.干热法：利用物理学，171℃-1小時、160℃-2小時、121-3小時:玻璃器皿20洁净工作室1无菌检查实验室分无菌操作间和缓冲间

2进入无菌操作间应有人净和物净的设施3无菌操作间内禁放杂物，每次实验后清洁消毒,并定期清洁、灭菌,每周彻底消毒一次,臭氧,消毒液0.1%新洁尔灭/75%酒精/其他交替使用4无菌操作间定期进行环境监测，可订为2周~3月，平时实验中实时做5无菌间使用的拖鞋要定期消毒处理6无菌间内紫外线灯要定期进行更换7实验前启动净化系统1小时,紫外灯1小时以上21无菌检查：注射剂、植入剂、部分外用药

鼻用制剂：用于手术或创伤的鼻用制剂。凝胶剂：用于严重创伤的凝胶剂。乳膏剂：用于烧伤或严重创伤的乳膏剂。新增的无菌检查中药制剂散剂：用于烧伤或严重创伤的外用散剂。鼻用制剂：用于严重创伤的鼻用制剂。眼用制剂：用于伤口的眼用制剂。软膏剂：用于烧伤或严重创伤的乳膏剂。气雾剂、喷雾剂：用于烧伤或严重创伤的气雾剂、喷雾剂。22无菌检查基本定义：检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。说明无菌检查法建立在批产品受微生物污染是均匀的假设上。即使该批产品的污染非常均匀，检出低污染的概率也是极低的。因此，无菌检查存在风险和局限性。应尽量抽取批产品生产开始和结束或生产过程出现异常情况下的产品进行检查。23药品生产中的污染来源人员在100级洁净区或万级背景下的局部100级洁净区。人是无菌药品生产中的主要污染源，在管理比较到位，生产设备自动化程度较好，操作人员素质较高的企业，人员操作所致的污染率超过70%。水源性微生物绝大多数为革兰氏阴性菌，不会形成芽孢，不耐热。其代谢产物及细胞的尸体及碎片均属细胞内毒素的污染源空气中的微生物基本为革兰氏阳性菌，有可能会形成芽孢使其耐热性增大24无菌检查的局限性无菌的定义理论上：无菌＝没有任何活的微生物实际上：我们无法证明产品中没有活微生物存在无法对整批产品进行100%检验无菌检验的结果只是一个基于“可能性”的判断无菌检验用培养基有其局限性只进行细菌和真菌的检验对实验结果的判定是基于“是否在培养基中生长”培养条件（如温度和时间）是有限的我们的工作环境及操作是在相对无菌的状态25美国非肠道药物学会注射剂无菌测试结果试验目的：不合格的可能性(%)试验批量：60,000支试验方法：按美国药典无菌测试方法真实的不合格率测试20支样品不合格的可能性测试40支样品不合格的可能性合格结果的可能性1％18.2%33.1%?5％64.2%87.2%?15％96.1%99.8%?30％99.9%100.0%?26上述无菌测试结果的启示含有少量微生物污染产品的批次也有可能“通过”无菌检验一批产品的染菌率越低，根据无菌检验的结果来判定整批产品的无菌，其风险就越大27如何用无菌检验来证明整批产品无菌要求有一个取样计划来涵盖整个批号有足够的取样量和检验量选择适用的培养基采用经验证的无菌检验方法良好的环境监控质量问题为何常常未检出来？28批产品出厂最少检验数量供试品批产量N（个）每种培养基最少检验数量注射剂

≤10010%或4个（取较多者）

100＜N≤50010个

＞5002%或20个（取较少者）大体积注射剂（＞100ml）

2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品

≤2005%或2个（取较多者）

＞20010个桶装固体原料

≤4每个容器

4＜N≤5020%或4个容器（取较大者）

＞502%或10个容器（取较大者）29上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少量（ml）最少检验数量（瓶或支）≤1全量2011＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(静脉给药)半量10100≤V≤500半量6V＞500500630上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M（mg/支或瓶）每支样品接入每管培养基的最小量（mg）最少检验数量（瓶或支）M<50全量20（1）50≤M<300半量10300≤M<5g15010M≥5g50010外科用敷料棉花及纱布取100mg或1cm×3cm10缝合线、一次性医用材料整个材料310带导管的一次性医疗器具（如输液袋）

10其它医疗器具整个器具3（切碎或拆散开）2031供试品抽验量和检验量

检验数量(对于检验)指一次试验所用的供试品最小包装容器的数量。

检验量(对于检验与验证)指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。每份培养基接种的供试品量。例如:1g规格的注射用粉针剂10支150mg*10表中最少检验量不包括阳性对照试验的用量。32供试品的处理

目的使供试品分散均匀水溶性供试品固体制剂β-内酰胺类抗生素供试品非水溶性的供试品膏剂和黏性油剂供试品无菌气（喷）雾剂供试品装有药物的注射器接种含培养基的容器按规定的温度培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。33无菌检测14天补偿次佳生长条件考虑到潜在的低生长者修复受损细胞全球一体化34阳性对照菌液制备加菌量为10~100cfu阳性对照管培养48~72小时应生长良好。35结果判断若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2日、真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。36当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。⑶阴性对照管有菌生长。⑷供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。重试37方法学研究：

验证试验的必要性方法验证：是为检测方法的可靠性提供重要科学依据。微生物检测的几个方面：1、无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测）；2、所有灭菌器具的验证；3、培养基灵敏度检测；4、阳性代表菌株的选择等；5、方法的选择等。2005版药典与USP、EP、BP国家接轨，将药品微生物检查方法的验证实验进行了，系统化的规定和要求。并强调了验证供试品本身对微生物生长的影响。38环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断39验证的目的实验操作的标准化验证试验的系统化制定标准的严谨化最终目标：一次检验即可得到准确结果。40方法验证的一般程序与环节

需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用样品检查去除抑菌作用①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。③验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。②可以通过验证实验判断

41验证什么？前处理去除抑菌作用用到的一切42方法的验证样品前处理直接接种法薄膜过滤法冲洗量的验证中和剂的验证43无菌检查验证实验：

供试品↓┌───────────────┐

直接接种法薄膜过滤法100ml/筒↓┌───────────────────────────────────┐①试验组（供试品+菌）②培养基对照组③阳性菌对照组④稀释剂对照组金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、（加菌同试验组）大肠、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念株菌、黑曲霉↓规定T培养3~5天↓观察结果↓书写验证报告44薄膜过滤法将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。

可少量多次：50-100ml/次；共次，充分振摇，在最后一次无抗菌活性时加阳性菌<100cfu/ml。45直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。46菌落计数:同时平皿法液体培养基计数47与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量；增加培养基的用量；使用中和剂如ß-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。48阳性菌株的选择枯草芽孢杆菌

Bacillussubtilis[CMCC（B）63501]金黄色葡萄球菌

Staphylococcusaureus[CMCC（B）26003]生孢梭菌

Clostridiumsporogenes[CMCC（B）64941]铜绿假单胞菌

Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]大肠埃希菌

Escherichiacoli[CMCC（B）44102]白色念珠菌

Candidaalbicans[CMCC（F）98001]黑曲霉菌

Aspergillusniger[CMCC（F）98003]菌液制备,计数一般当日使用49阳性菌株的选择应根据供试品的特性选择相应的阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。否则会造成误判!5048小时细菌实验结果

金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌生孢梭菌冲洗量300ml/桶+酶300万单位--+-+冲洗量400ml/桶+酶300万单位+++-+冲洗量500ml/桶+酶300万单位+++++阳性对照+++++阴性对照-----72小时观察真菌结果

黑曲霉菌白色念珠菌冲洗量100ml/桶++阳性对照++阴性对照--无抑菌作用、弱抑菌作用的可以从直接过滤不冲洗开始做，但一定要做！51葡萄糖注射液注射用头孢地嗪注射用克林霉素磷酸酯替硝唑注射液红霉素软膏实例5个52无菌检查原始记录检品编号：第页共页53微生物限度检查：口服、外用控制项目

杂菌数：细菌数、霉菌和酵母菌数。

控制菌（致病菌）：大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、梭菌。制定原则：非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者潜在的危害而制定的。54不含药材原粉的制剂含药材原粉的制剂：丸剂含动物药的制剂：外用制剂：滴眼剂一般局部用药直肠给药制剂尿道、阴道给药制剂滴鼻剂不同制剂的限度55供试品制备液体供试品:10ml固体、半固体或黏稠性供试品10g,匀浆或其它适宜的方法非水溶性供试品具抑菌活性的供试品:①培养基稀释法②离心集菌法:500,3000rpm③薄膜过滤法④中和法;如磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸56供试液制备供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃57采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性58结果判断供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种的规定。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种的规定，判供试品不符合规定。59微生物限度检查法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证

定量——回收率测定实验控制菌检查方法验证定性——能否生长、专属性实验60回收率计算

试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100%在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组、试验组的回收率均不低于70%，若任一次试验中回收率低于70%，应重新选择方法再验证。61方法验证：控制菌控制菌：大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，沙门菌，大肠菌群，生孢梭菌计数方法：平皿法、薄膜过滤法。特殊：生孢梭菌（加菌量：10~100cfu,只要求生长，不要求回收率）622010版药典无菌检查法的主要增修订情况63增、修订涉及范围

前言部分培养基部分灵敏度检查稀释液、冲洗液方法验证薄膜过滤法培养及观察结果判断表1、表2和表364

前言部分1、新增规定：“防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。”2、新增规定：“日常检验还需要对环境进行监控。”3、新增规定：“无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。65干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛酚类、乙醇、吸附物醛类季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯汞类制剂双胍类化合物碘酒、洗必泰类卤化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺类ß-内酰胺类抗生素亚硫酸氢纳稀释法稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐卵磷脂、聚山梨酯亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐卵磷脂聚山梨酯硫代硫酸盐镁或钙离子对氨基苯甲酸ß-内酰胺酶表1常见干扰物的中和剂或灭活方法66

培养基灵敏度检查部分新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的贮存期内使用。”67

稀释液、冲洗液及其制备方法部分

在原有1.0.1%蛋白胨水溶液2.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的基础上新增加：“可根据供试品的特性，选用其他经验证的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。”68方法验证试验部分验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度