凝胶过滤层析法教学专用课件

凝胶过滤层析法凝胶过滤层析

（分子筛层析、排阻层析）

7/29/20231一、凝胶过滤介质凝胶过滤(gelfiltration)是利用凝胶的网状结构根据被分离物质分子大小进行分离的一种方法。凝胶过滤的优点：1、介质为不带电的惰性物质，不与溶质分子作用，分离条件温和，收率高，重现性好2、工作范围广，分离分子量的覆盖面大3、设备简单，易于操作，周期短，可连续使用。7/29/20232凝胶过滤介质应具备的条件1、介质本身为惰性物质，在应用过程中它不与溶质、溶剂分子发生任何作用2、应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少非特异吸附性，提高蛋白质的收率3、介质内孔径大小要分布均匀4、凝胶珠粒大小均匀5、介质要具有优良的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒，延长了介质的使用寿命7/29/20233常见的凝胶种类1、多糖类骨架的介质：以天然多糖为母体的凝胶过滤介质，这类介质具有亲水性及与生物大分子的相容性，可允许生物大分子透过而不发生变性。这类介质的缺点是多为软基质，压力降大时不易操作。因此在经典的多糖类介质的基础上又生产出刚性、半刚性的骨架和琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶(超胶Superdex)高效介质。7/29/20234凝胶过滤介质的种类2、合成大分子骨架的介质：选用高亲水性单体，经共聚反应而合成的多孔结构过滤介质。主要产品有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系及羟甲基酰胺类。3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质7/29/20235主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构7/29/20236主要的凝胶过滤介质(一)、葡聚糖系1、葡聚糖系—Sephadex结构：以氯代环氧丙烷为交联剂的葡聚糖珠状凝胶，依据孔径不同形成G型凝胶系列产品，G后数字表示凝胶的吸水量，是其吸水量的10倍。G也表示凝胶交联度的大小，G越小，交联度越大，孔径越小，排阻的分子越小。7/29/202377/29/202382、性能：(1)溶胀性Sephadex系均以干态供应，使用前必须在过量的溶剂中充分溶胀后才能使用。(2)化学稳定性Sephadex不溶于一切溶剂，在水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸溶剂中均较稳定。因葡聚糖中的糖苷键在强酸中可发生降解作用，所以只能接触强酸的稀溶液，在0.1mol/L盐酸中可接触1～2小时，在0.02mol/L盐酸中经6个月均无明显变化，但要避免作用氧化剂。7/29/20239(3)物理稳定性pH中性湿态珠体可经受120℃、30min高压灭菌而不影响色谱性能(4)机械强度Sephadex凝胶的机械强度取决于交联度，交联度越大，机械强度越高。机械强度与柱床所能承受的压力有关，其压力与流速的关系为：V=K×ΔPLV：线速度，cm/h；ΔP：压力降，cm水柱；L：床高；K：比渗透率，受粒径影响较大。7/29/202310葡聚糖凝胶(G)型号分离范围(分子量)吸水量(克／克干凝胶)膨胀体积(毫升／克干凝胶)浸泡时间蛋白质多糖20～25℃90~100℃10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-407257/29/202311Sephadex的型号及性能7/29/2023123、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。4、衍生系：在经典葡聚糖凝胶的基础上，引入特殊基团后生成葡聚糖凝胶的衍生系，主要有LH系，如以G25为母体引入羟丙基成LH20，以G50为母体引入羟丙基成为LH60。特点是LH系除具有凝胶过滤的作用外，同时具有分配层析及吸附层析的作用。7/29/202313Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。LH系列主要用途：①用于有机溶剂中的凝胶过滤，尤其适用于嗜脂性分子及制备各种天然产物；②结合凝胶过滤、分配层析及吸附层析的特点，能分离结构非常相近的分子及其他凝胶难以处理的样品；③

排阻极性与原母体凝胶相同。LH20对芳香多环化合物的分离比LH60好而LH60更适用于分配层析。④对样品的负载量大，负载量可高达300mg/ml凝胶。7/29/202314(二)、琼脂糖系由经过纯化的琼脂糖制备，其中含有极小的带电基团。利用琼脂糖热溶液冷却时可凝胶化的特点，能方便地制成珠状物。在凝胶过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚集成胶束。胶束之间有孔，孔的大小取决于胶束的多少即琼脂糖的浓度。传统的琼脂糖凝胶非特异性吸附极低，分离范围很广，分离范围从10000～40000000，所以适用于分子量差距较大的分子间分离，分辨率不很高。琼脂糖凝胶有两种牌号Bio－GelA系和Sepharose7/29/2023157/29/202316Bio－GelA系型号及性能7/29/202317Sepharose系型号能性能7/29/202318Sepharose是该系中最早的产品，为非交联结构，因此不能进行高压灭菌，仅能在2～40℃范围内使用。根据琼脂糖含量的不同，对含量为2％、4％及6％的产品分别命名为2B、4B和6B。由于新型凝胶的不断出现，此型凝胶有逐渐被淘汰的趋势。7/29/202319SepharoseCL是琼脂糖珠体与2，3－二溴丙醇反应后具有共价交联键的产物。交联结构大大提高了珠体的热稳定性及物理化学稳定性，但对孔结构无明显影响。交联后凝胶在还原条件下经碱水解去除了硫酸根，减少了带电基团，使非特异吸附比其母体小。凝胶在中性条件下可经受120℃消毒，处理后其色谱性能不变。特别适用于含有机溶剂的分离，流速比传统的Sepharose有明显提高并可广泛用于离子交换剂及亲和吸附剂的母体。7/29/202320Superose由珠状琼脂糖经过两次交联而制备的新型凝胶。用含双环氧基及多环氧基的混合长交联剂对琼脂糖珠体进行第一阶段交联，然后再与含双环氧基的短链交联剂进行第二次交联。经两次交联反应后的珠体大大提高了介质的刚性和增强了物理化学稳定性。用0.1mol/L的HCl溶液及0.1mol/L的NaOH在40℃处理两周，色谱性能无明显变化，还可经受70％甲酸及30％乙腈处理。7/29/202321Superose为刚性－半刚性珠体，在高黏性液体如8mol/L尿素下也能保持适当流速将广泛的分离范围及高分辨率集于一身，适用于糖类、核酸、病毒等的分离，特别是包含体蛋白在促溶剂中的纯化。能一次性分离生物分子大小差异较大按的混合物。由于颗粒细小，粒度分布均匀，柱效高，可允许高流速，适用于中、高压层析系统分离。7/29/202322SepharoseFastFlow是新型的BioProcess凝胶介质，经过高度交联的琼脂糖珠体。具有机械强度高、流速快、极高的物理化学稳定性及非特异性吸附极低等特点，而适合工业规模生产使用。对蛋白质的回收率很高，并可用多种促溶剂及有机溶剂或1～2mol/L的NaOH进行清洗。7/29/202323(三)、聚丙烯酰胺系由丙烯酰胺与N,N’－亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的亲水性凝胶。是结构稳定的合成高聚物，不受微生物侵蚀，可在120℃消毒30min后，色谱性能不变。干胶的羧基含量≤3.0mmol/g，含有极少的游离电荷，所以非特异性吸附很小。还可以通过改变交联剂的用量控制凝胶孔径的大小，得到不同排阻极限的系列产品。7/29/2023247/29/202325Bio－GelP类凝胶7/29/202326(四)、Sephacryl系列由烯丙基葡聚糖与N,N’－亚甲基双丙烯酰胺经共聚而成的一种共价交联的刚性珠体，有6种不同的分离范围，具有广阔的选择性，具有良好的机械性能，可进行快速的高分辨率的纯化。其稳定性能可用0.5mol/L的NaOH进行清洗及再生。由于其化学稳定性，使其既适用于水溶液，又可用于多种有机溶剂体系。可在科研及工业生产中应用。7/29/2023277/29/202328Sephacryl系列产品性能7/29/202329(五)、Superdex系列产品是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。7/29/202330Superdex结构7/29/202331Superdex(BioPrecess介质)素列产品性能7/29/202332(六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质，20世纪80年代初部世，由美国R&H公司与日本曹达公司联合开发。是多孔的三维网状结构，大分子链上含有丰富的羟基，使其具有高度亲水性，进行化学改性后可转变为含有多种功能基的离子交换剂及亲和吸附剂。FractogelTSK是该系列的类似产品，适用于HPLC(高效液相层析)。7/29/202333Toyopearl系型号及性能7/29/202334二、分子筛原理7/29/2023357/29/2023367/29/202337凝胶层析中常用的术语和参数7/29/202338床体积：膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）表示。Vt=V0+Vi+Vg内水体积：是层析基质颗粒内部所含水的体积，用（V0）表示。外水体积：层析基质颗粒之间所含水的体积，用（Vi）表示。基质体积：层析基质本身在层析柱中所占有的体积（Vg）表示。7/29/202339膨胀度：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积，用Vg表示。即每克溶胀所具有的床体积。分配系数：指一组分在固定相与流动相中含量的比值。7/29/202340凝胶过滤的分配常数Kav=

Vt-VoVe-Vo在给定的条件下，Vt和Vo都为恒定值，而Ve随着分离物分子质量的变化而变化。对凝胶过滤，其分配常数应在0≥Kav≥1。当被分离物质完全排阻时，Kav等于0，Ve等于V0；当被分离物质自由扩散时，Kav等于1，Ve等于Vo＋Vi。7/29/202341从上式可以看出，Ve、Vo可通过层析过程中测定，只要测出Vt即可计算出Kav。Vt是凝胶过滤柱床总体积，由三部分组成，即Vo＋Vi＋Vg。

Vt＝πr2h或用Vt＝Vo＋Vi＋VgVg很小，可忽略不计。V0一般用蓝色葡聚糖2000测定，其分子是为200万，呈蓝色，在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可直接观察。7/29/202342Vi的测定：选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出洗脱体积，减去V0就是Vi。常用铬酸钾来测定，铬酸钾为黄色化合物，可直接观察，优点为不与葡聚糖起任何反应；也可用硫酸铵测定，用硝酸银检出洗脱峰。7/29/202343常用参数：

1/2h0.607h7/29/202344如图所示为一色谱流出曲线：7/29/202345基线：在正常的操作条件下，仅有流动相（无被分离样品）通过检测器时所产生的信号。层析峰：样品从洗脱开始到样品流出层析柱时，检测器对层析样品和层析时间所产生的信号。峰高：峰的最大值到峰底的距离。峰宽：层析峰半高峰时的宽。峰面积：峰与峰底间的面积。7/29/202346层析峰区域宽度半峰宽：峰高一半处的峰宽度。峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。Wb=4σ=1.699W1/2W1/2=2.354σ7/29/202347保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。保留时间和保留体积：样品组分通过层析柱出峰所需的时间称保留时间；样品组分通过层析柱出峰时所需流动相的体积称保留体积。7/29/202348死时间或死体积：柱中未被固定相所占有的空间，如柱的接口、柱出口管路、检测器内腔空间及柱内填充空隙等称为死体积；流动相流经死体积所需的时间称死时间。调整保留时间或调整保留体积：保留时间中扣除死时间后的时间；或保留体积中扣除死体积后的体积。7/29/202349分离度：指相邻两峰的保留时间差值是是两峰宽平均值的几倍。因Wb=4σ，即分离度为1时，ΔtR＝4σ。两峰有98％分离。Rs＝＝

tR2-tR1½(W1+W2)

2(tR2-tR1)

W1+W2当W1=W2，且峰面积相等时

Rs＝ΔtR/W7/29/202350柱效：层析过程是一个连续过程，流动相不断流过，在任何一点上实际上都无法获得平衡，当流动相通过柱的一定高度，在离开这段柱时，流动相中某组分的平均浓度与固定相中的平均浓度可以达到分配平衡，完成这一平衡所需要的柱长称为理论塔板等效高度，简称板高N=L/H7/29/2023517/29/202352凝及的选择和处理凝胶的选择1、凝胶的选择(1)型号的选择：选择时主要根据凝胶的筛分范围、凝胶分辨率及分离目的而确定。(2)粒度的选择：2、凝胶用量的计算：根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度按以下公式计算；干凝胶用量(g)＝πr2h膨胀度(床体积/g)7/29/2023537/29/2023547/29/2023557/29/2023563、凝胶的处理：将所用的干凝胶慢慢倾入5～10倍的蒸馏水中，按凝胶本身的要求进行溶胀时间进行浸泡，弃去上层悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液在室温下浸泡0.5h抽滤除去碱液，用蒸馏水洗至中性。注：为除去凝胶中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水或平衡液中以抽真空的方式实现。也可采用加热煮沸的方法，这种方法可在除气泡的同时加快溶胀速度。但不能在酸或碱液中加热。7/29/202357三、层析柱1、柱的选择：与一般离子交换用的柱结构相同。近来多用多孔的聚乙烯片做底板，也可用尼龙滤布制成挡板。活脱液流出后的空间为死体积，层析的死体积越小越好。7/29/2023587/29/202359一般来说，用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；用同样长的层析柱分离两种以上的物质时，直径大的比直径小的柱分辨率高。凝胶过滤柱的径高比(D/H)一般在1:25～1:100的范围之间，也有特殊要求的凝胶过滤的柱径高比更大。对凝胶过滤层析柱最好有夹套，这样可以便于温控。7/29/2023607/29/2023617/29/2023622、装柱3、上柱、洗脱与收集样品的上柱量与以下因素有关：样品检测的灵敏度凝胶介质的性质样品的粘度分离的分辨率混合物中各成分的性质差异7/29/202363上样量对层析结果有直接的关系，上柱体积比上柱浓度的影响更大。7/29/202364在凝胶过滤层析中，流速是重要的参数，流速与层析的分辨率有直接的关系I、层析柱：2.6cm×85cm,流速2ml/cm2×h-1II、层析柱：2.6cm×85cm,流速25.5ml/cm2×h-1III、层析柱：2.6cm×19.5cm,流速24.5ml/cm2×h-17/29/202365在凝胶过滤层析中，样品的粘度也是一个需要考虑的因素。一个粘度很大的样品上柱后，样品分子因运动受限制，进出凝胶的孔隙不易，因此峰形显得宽而矮，有些可以分离的组分也会因此而重迭。结果如图：7/29/202366血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱：4cm×85cm,SephadexG-25;流速：180ml/cm2×h-1未加葡聚糖2000，粘度：1.0厘泊7/29/202367血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱：4cm×85cm,SephadexG-25;流速：180ml/cm2×h-1加2.5%葡聚糖2000，粘度：4.2厘泊7/29/202368血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱：4cm×85cm,Seph