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文档简介
第七章基因结构与表达分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes主讲人:罗志勇教授11.DNA双螺旋结构发现(Watson
&Crick,1953)概论TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine19622PresentationSpeechbyProfessorA.Engström
Dr.FrancisCrick,Dr.JamesWatson,Yourdiscoveryofthemolecularstructureofthedeoxyribonucleicacid,thesubstancecarryingtheheredity,isofutmostimportanceforourunderstandingofoneofthemostvitalbiologicalprocesses.Practicallyallthescientificdisciplinesinthelifescienceshavefeltthegreatimpactofyourdiscovery.Theformulationofdoublehelicalstructureofthedeoxyribonucleicacidwiththespecificpairingoftheorganicbases,opensthemostspectacularpossibilitiesfortheunravellingofthedetailsofthecontrolandtransferofgeneticinformation.
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CentralDogma2竿.中冲心冒法猜则傅提馋出(C漂r封i吉c灭k,1赵9泳5稻8)C匪r族i味c浸k射,性1芹9殃1聪6宏-唤2忧0湾0哑44反扣转酬录亮机书制雷阐碰明(T业e柏m咏i餐n1形9帅7棚0)补充的中心法则5中柴心船法凝则勿:代甘表拍了甲大置多阅数恐生姿物冰遗墙传顿信谈息边贮关存般和屈表黎达欲的垦规梦律维,奠瘦定绸了衬从带分纷子棕水桥平怪研画究浇生流命福科惹学湿关厅键积问吐题妥的盒理手论敬基铁础吊。63.基因表达(geneexpression):
从DNA到蛋白质,通过转录和翻译,用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质。74肌.基挡因效结湿构隔与科表烂达神分梯析技付术权:Northernblot※Real-timeRT–PCR※基因芯片DNA序列分析※Southernblot※FISHDNARNAWesternblot※
蛋白质芯片蛋白质8讲漫授馒内互容认:(Ⅰ)D共N缠A序代列输分脊析※(预Ⅱ策)核疏酸票分娃子愉杂是交※(Ⅴ)聚窑合尚酶恼链蹦式减反难应※(Ⅲ)基皮因房诚芯导片保和主微穷阵百列(Ⅳ)W监e沾s轻t染e饰r或n免象疫勺印嫁迹※9(幸一水)双相脱代氧纹链躺末例端津终燥止岸法※(伍S谦a呜n仆g铁e沿r墓,宣1到9孤7膨7象)(赌二议)功化臣学嫌裂页解君法(碎M愧a瞒x参a誓m&G径i堆l辨b虎e非r妈t咬,张1药9惭7棚7串)(悄三泻)D申N铲A自抽动铲化纺序敌列障分且析一卖、D叔N般A序信列外分局析1脱0D乌N票A测炸序隙技辈术之基职础伞:
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高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)技术
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PAGE能分离长度为300-500个碱基,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。1清1(棍S抗a惹n饰g劲e朴r,肆U奋KM卸a竞x匪a雀m&G锦i窃l湿b陵e堂r郊t,监U乔S踪蝶A遵)共丑同末分盛享N驳o渴b按e垦l化准学漂奖(咬1耀9找7坛9吼)1虑2(一草)杰双屋脱军氧听链泳末余端贸终或止第法(d那i缸d晓e挽o锐x冒y色c付h山a宅i袄n晒t酸e漏r此m免i臂n勿a旷t渠i转o喷n)以D处N萌A合衬成反奏应汉为终基鲜础扶。(闯S皆a慨n迷g案e戒r谱)1朋3A芳T冶P、d令A臣T港P和d鬼d转A店T厌P的恳结刘构ATPdATPddATP1漆4
DNA合成反应掺入N个核苷酸掺入N+1个核苷酸1扒51.双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中,ddNTP不存在3′-OH末端,故不能与下一个核苷酸的5′-P端形成3′,5′-磷酸二酯键,导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP
。1认6
末端终止部位DNA单链模板引物延伸的新合成链掺入ddNTP1枕72退.哪D饿N勿A测堆序选主暴要仗步稳骤●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备
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DNA模板与测序引物退火●掺入法标记反应●延伸-终止反应●放射自显影●阅读测序结果1哄8测城序疑步碰骤1除92佳0G反兵应喊管A反应管C反应管G反应管T反应管2杰1G赏A欢T熊C2砌2
与末端终止法不同,化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。
(二)化学裂解法2彩3
将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记,标记的DNA片段分成四个反应,分别用不同的化学试剂处理,造成碱基特异性切割,使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。1.化学裂解法原理2歌4化狸学舰降枯解G反吧应碑模际式代图硫酸二甲酯哌啶M脸e婶tM灭e窄tM笼e忠tM厕e意t2授5(衡三惨)D塔N毛A测棋序弄自沿动尊化膛原满理采喇用4种因不棕同业的肿荧赚光沸分剩别饭标桂记4种d押d蕉N赌T谦P终壁止柏反套应临产煮物渗,乌替迫代盏放叼射倚性腊同脾位罪素晚标幻玉记属是纽奉实毒现D碑N兴A测赏序认自屡动纷化灭的荡基张础滥。2亮61骗.惊D名N眼A自浊动落测放序秃步太骤劝:4种抢带莫有放不医同考荧搬光拼染付料捧标歪记鞠的恼终堵止蜜物d践d裤N仰T异P阳sS西a翠n摇g晨e恳r测孤序婆反愚应反迁应持产慈物眠毛妈细柏管籍电收泳谢分踩离2素7荧骆光红信爹号克采支集望、奏计该算黑机泰分摆析桂与D辈N扬A自给动售排百序。激收光何激丧发渗不迅同义大赵小D挂N箩A片产段橡上粮的粱荧鲜光泛分相子陈,乳发贪射躁出楚四休种兔不症同骂波糖长爹的烘荧释光2莫82洪.危D汇N戏A自稠动滴测畜序介结拔果2墨9(皇Ⅱ姻)核细酸怒分愚子瓣杂碍交N遥u富c进l下e尤i宰c盐A沸c家i剃d暖H奔y超b帖r众i怠d静i破z完a钱t法i怪o稳n3惕0●细志胞纺原皮位包杂例交(P指a接r捐d尘u令e适e显t渴a院l,1宫9澡6厅9豆)●S船o悉u累t捉h皇e铺r拌n印樱迹瞧杂击交※:检缠测D线N遭A(S流o少u青t森h伏e贩r幸n代E裙M,1渴9皱7名5)●N奴o漏r范t普h内e涛r牲n印辟迹脆杂蚂交※:检删测R皱N协A(S佩t琴a虫r壤k辫G情R,1熊9拥7个7)核师酸间分历子脾杂律交类技演术货的歌建伯立3慢1核底酸巷分描子该杂斧交饿原糟理标渣记赚的单狮链单核挺酸国探斥针与铜待凳检阁测似的番靶酒单扛链D赞N向A或R锦N扣A局公部棍互竭补氧结棕合杂形峰成滤杂犁交耻双痕链督。应俭用烛:核僵酸晚靶D般N未A或R劣N帝A序妥列彩的剑定培性灵与抹定股量婚分田析仆。3翼23弯3一茶、S迈o丙u莫t迹h钉e白r陷n印娱迹吨杂女交(鼓S功o团u亿t醉h捎e绍r嚼n给b煎l捉o池t知h墓y砌b楚r毁i具d败i妨z墨a鉴t否i厌o绕n圾)将等电吊泳幕分遣离治的待是测D孕N铸A片李段聚结告合快到境一暂定敞的间固列相溉支膨持睁物宇上速,贯然孝后霜与撤存岩在合于辛液待相省中尺标钱记止的计核置酸许探弦针武进翠行败杂问交罪的桨过鸣程望。3游4PaperTowelsSouthernBlotting1t近i恐s阻s仰u磁eS思D恭SP社r汁o贺t造KP蜜h江e坡n屋o片lC父h给l荐o串r岗oE膛T熔O汽HS吩p是i站n3女5AgaroseGelElectrophoresis_+33非6二绘、N繁o腐r吸t顿h剧e兔r鉴n印尚迹藏杂挣交(搬N阻o挽r谣t欠h厘e比r宿n鞠b勾l匙o镜t套h丹y矩b具r热i愧d置i水z充a榨t在i疤o突n冠)指挺将R仅N顷A变冈性输及测电萝泳章分音离超后叹,编并讲转好移碗到术固劈燕相旗支夫持宣物甘上敏,天用典杂液交浑反纹应扮来洞鉴假定质其钉中特晴定m吼R领N海A分转子橡的夫含喝量曲及介其没大躺小魂。3澡7R茫N挠A琼满脂辅糖胁凝指胶陶电枯泳3kb0.4kbNt36382604623N描o漆r级t稍h协e迈r纽奉n珠b恳l兼o袜t崇h企y既b屑r厕i耕d搂i冶z此a保t基i触o论n28S18S应门用青举误例3状8GAPDH0d2d4d6d8dN谁o秤r卖t踏h坟e泡r流n子b株l郊o冶t杂鬼交仆分右析m校R笔N道A的访表达靶m研R忽N坛A3还9三南、策其杆他惰杂求交检技为术(一)斑精点府杂以交(劳d钞o盆t适b但l榜o拢t泥h绩y眨b昨r仇i喇d呀i搁z筐a较t畜i队o趁n):将R都N务A或D话N叙A变购性歼后波直逆接须点仍样傻于数硝远酸荒纤过维撕素蔑膜愧或躁尼总龙苹膜响上箱,用促于千基塞因侵组袜中度特例定加基绣因妻及煮其项表惜达曲的惧定佛性隔及责定争量态研医究业。●●●●●●4临0(容二民)准原东位昼杂冬交(i她n杯s薯i多t嘉uh脖y根b朝r挂i讲d铲i钩z努a苦t介i镰o渐n)用婶标警记时的撑核继酸上探崇针匹与竞组压织遭切竹片优或掌细亦胞作中哄的圈待碧测蛇核调酸徐互坏补毙序驶列夫杂吊交缝,魂可姓对玻核饥酸烦进轧行厌定芳性技、计定舍位滴和妇相饭对歪定男量坐分摄析么。4荡1(烧三钢)识液疤相均杂迁交(歌s怖o锦l杆u史t皂i认o贸n藏h衡y头b贫r坊i专d舰i员z晒a龙t顾i闪o耽n尤)1.编核摄酸犬酶S佳1保蜂护紫分巧析孟法(所n刚u臭c旱l芝e继a读s弦e饰S中1锻p竹r回o句t辈e亏c罩t叠i屯o今n姐a士s称s先a督y)单劲链D照N乒A探丸针商与护待劳测R虚N吴A形昏成D妙N惰A陆/抗R用N化A杂旱交胡双娱链付,其加合入华核忍酸头酶S写1专亩一淡性爽地所降逗解你未落形味成镜杂剧交尖体境的D粱N序A或R首N丛A单坦链秆,D找N红A平/饱R罢N寻A杂搞交培双曲链缸则帐受促到章保让护坑而旺不源被喘降即解微。4股22.R棒N和A酶拨保愉护惩分削析墙法(R饱N峰a养s过e盟p遍r寒o抢t祝e然c队t亏i绑o堵n赞a祸s雄s探a获y,R肝P鬼A)4霜3R翼P似A基贿本猪程铅序拉:●待摔测R驳N厌A的岩分每离●体授外辉转谁录厨标忘记R暗N次A探膝针●待瓜测R薪N慨A与悠探加针R除N挑A进椅行僚液捕相妨杂运交●R馒N址A酶械消喷化●不卸同窃大律小签杂长交代片底段底凝骡胶袖电泛泳哨分捏离4丙43骗.抑屿制存消范减扣杂疫交娘原聪理(s鞠u求p揭p芹r编e热s安s搏i肌o蔬n敞s铁u糟b逝t厕r恶a楚c阀t盗i盯v腾e恒h蒙y塘b哀r韵i沙d视i碧z垫a占t差i袋o皂n,S帖S温H)以仿杂龟交忽为花基雅础属,毁并小与P陪C努R技千术俱结挑合删的c界D徐N增A消明减钥杂德交世方抗法慎。应做用案:差帜异锐表库达宣新慕基迈因纯的划筛模选至与愈克买隆筑。4硬5S俗S萍H原涝理4艰6c渴D勇N锅A傍C弱h颗i闻p痕a凡n粥d擦M闯i天c节r霉o罚a谜r授r察a滨y(Ⅲ)基灯因爱芯屋片浇和摘微搅阵壤列4狗7●基棋因姻芯绪片筐上班的粥阵纤列闲是埋由身有福规读则脑排骂列纪的c害D崇N杰A或欺寡压核弊苷究酸派等植样节本眉所瓶组电成喷的径。●基夏因私表牢达删高蜜通收量胃分恐析恋法。4膏8D禾N筹A微膀阵巩列炮:●c志D社N用A微仰阵啦列许(c根D糕N钞A挺m恋i惠c沿r你o寄a残r押r块a角y)●枝寡蕉核旷苷勺酸耳微谢阵泪列洁(o惰l激i财g起o暗m欠i罗c企r钥o枪a萌r验r疤a均y)4吩9c伶D创N着A微德阵肤列:在丽一言微迟小各的尖基颜片冲(染硅泼片桌等波)咸表稼面红集期成车了尊大家量居分走子生识砌别塑探杏针宅,苍能赵够穷平矛行肌分镜析秩大索量次基姻因周转酸录悲表园达餐,毅因逆此昆又邪被犁称皂为c孕D亮N榜A芯糠片灯。5闻0基因表达谱芯片主要技术流程:样品荧光标记芯片制备芯片杂交芯片洗涤和扫描扫描图像分析1旷0晓25伙1核炮酸份杂棍交碰技疮术兰和枕微杆阵里列远芯鬼片克懒隆D殃N叼Ac绳D宵N测A标码记阵国列(纪A完r邪r塘a妹y仗,史M末a砍c舰r纷o翁a哲r忌r稿a铅y你)杂筐交仙、序显案影高触密柏度微尾阵浊列(净M廉i期c宣r怨o倍a能r华r贷a置y弊)1爸0色35笑2CBAC霞y舅5震-标削记c两D暂N羽AC痰y焰3寄-标刊记c炮D浩N血ACBACBACBACBACBACBA样冷品1样神品2C无y新5她/尾C跑y盖3荧知光浓标曾记R族N寸A提层取竞克争疾性既杂真交振显弱示基楼因劳表揉达故量携差凤异二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理1解0诞45妇3生燃物侧学逗问酬题肉提沾出难,堪表危达耗基剪因滩分劝析偷,州样腔本利分掠类盖与自实的验躺预监测.实怎验这设藏计基射因鸭芯元片搁实兽验图籍象雪分予析结洪果鄙标照准项化基例因睛表矿达获谱忆芯立片译研帮究绿应其用桂思汽路1沙0窗55晨4某析些歼基锈因软表董达肉异私常窗或番存付在规差油异生芽物事学乒确踪蝶证刻和辩解氏释贝分狭析下挤一冻步惠实池验应设谊计5终5●
cDNA芯片可定量监测大量基因表达水平,阐述基因功能,探索疾病原因及机制、发现诊断及治疗靶基因等。cDNA芯片在医学中的应用●Northernblot或RT-PCR验证。●基因表达数据的生物信息学分析。5汉6(Ⅳ)W耻e劈燕s允t插e膛r裁n免轰疫宰印丘迹W谊e云s溉t形e筛r妖n座b盖l息o割t原施理稼与晋核腹酸闯分姓子旦杂餐交单相术似喉,站只病是老以座偶数联蛇标当记攻物迹的被抗阅体陈分删子伪作肤为铃探促针爱,着检伪测嚷转村移义到评固厕相心支隙持挺物怪上惕的元蛋仅白习质裳分系子携。5咸75肚8W甩e兽s尺t进e毙r潮n块b争l李o扎t程松序描:●蛋嘉白六质妈样脖品集制薪备●S糟D阀S质-丛P萍A仔G民E分既离●蛋柏白刊质明转寒膜●标签记突抗蹈体轿与广膜舰上术蛋歇白央质正抗去原疾杂贤交●检搜测阿并记分闯析漏标疲记漂物铺信桃号5戒9W骡e胳s吼t贿e户r么n免捞疫歌印皮迹立信唐号烫检滥测挡原霞理6喂0L妨u颠m叔i行n节o腿l化胶学霜发纹光涨原禁理6鼻1另夸一遍种责信跨号说显喊示前方陈法括是治在制洗锐去怕一司抗棕后迅,炒加摇入劲碱乌性脸磷姿酸题酶便标占记绳的撒二磨抗贝,颤再叶用B遥C栏I骡P/N圆B炮T在普膜限上茧直短接粮显暂色项。6堂2免搅疫屈沉臂淀肤技漫术是去一菊种岛抗堂原岗抗铅体膊反撑应透技梢术李,睛只绑是今将正抗雄体丹分特子全先敢结隐合料到送固刘相裕载影体舱如捞磁鹿珠良上忘,缺然失后泊与绒含剩目侵标偷蛋着白斯的勺细岛胞滴裂字解奏液倚进宅行均液含相槽杂竿交把反躲应业,甜利录用兆磁册场蓝或社离缴心凯等批技拘术怪将徒结棕含年在钞抗乱体快上茂的雾蛋忽白梁质钞收啦集杰起清来芬,超电泊泳局分棵离喊,孔用偿于W喇e粪s吴t逃e贪r疯n雄b爆l早o犬t分现析锁。6钱3(Ⅴ)聚赌合的酶匪链港式状反府应P誓o牧l困y腾m搞e取r利a枝s果e渗C级h斤a巷i颤n眉R渴e惕a夏c姜t卡i斯o倚n6杯4引拾言●P梢C酿R技表术晒发矩明(1希9绕8部5,M谋u些l哄l挡i流s涂K萍.)●P量C狡R及航其皇相驳关街技笋术发殖展渔速纽奉度收惊宜人桂、应识用诉迅均速库广顾泛(票分盗子帅生章物志学勿、鸭医皱学昂、梨生右物回学故、赶考喂古仆学配等列学认科酬领衰域较)●获N辉o刑b鸡e晨l化痕学内奖(1咸9液9邪3,M着u愧l论l但i季s宁K戒.)6辟5讲脉授解内短容物提明要:一惨、P摧C库R技疗术颂原昏理二戏、裙耐馅热D读N割A聚兰合销酶三秆、P误C杀R引箭物退及松设地计油原流则四蒜、P冷C峰R条暂件膛的渗优膛化五遗、P热C奥R改族进啦技石术6跃6聚号合擦酶滩链叔式古反扫应(调P洒C递R千)江:一钩、P兄C恋R技斧术原原赖理
Mullis
K.
1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。
TheNobelPrizeinChemistry19936约7D混N独A复达制●半朗保亭留傅复坡制●半妹不烫连没续住复属制●冈逮崎咸片市段领露头溜链随桥从垒链6周8引林物拴的饿化辰学难本援质业是嘱什紫么呆?单哗链暑寡慈核乎苷咽酸D盆N丘A或R俗N变A片裙段翼。D足N医A复残制暗引刷物信:殿单漏链R铃N狭A片愿段P脚C歌R引文物屡:腊单没链D隆N井A片想段6盛9(眯一纱)P怪C姥R基春本伐过链程1卫.顺P锡C底R循恶环岩由吸三创步瓜组桶成映:①即变蹄性(d揭e花n泥a幅t科u填r肺a串t届i惜o痒n)②桌退恐火(a悬n破n俗e捷a吐l侵i煎n填g)③牙延扣伸(e和x添t带e句n姜s仰i蹲o帆n)7野0PCR原理低凡温且退寺火高奋温胃变饼性中梯温柄延灭伸7涌1在独模蓄板D请N异A、语引堡物升、4种d笛N嚼T罗P存钳在束条中件胳下累,帽依裕赖D垮N仁A聚芒合束酶催屿化鬼一脚对抵引说物心间青特要异D锋N中A片盯段叮合纸成的秆体犬外恒扩密增岁技沾术产。2煌.P差C径R定镜义草:7饲23坛.嗽P携C借R扩获增安终篮产雷物码大毁小:介斗于轿两策条牙退碎火夜引饲物5夕′末堵端竟之水间闪的双欣链D息N蔽A片皱段。7楼34下.什盾么银叫浪引摆物生延宰伸佛产南物哈?比消两块引信物痒限娇定盟区猴长俗的伪延爹伸凡产示物蛮。仅舍发砌生梨在造以杏原激始畅模多板D铜N堤A为风模年板忧的岸扩脏增鸭过发程投中,到以讲倍握数延形祥式菠扩借增(绒2驴n类)。7稼4Y稀=部A(1帆+暴E)nY档:扩蛋增宪产目物抚的目量A天:最肢初赵靶D手N恼A分吧子族数E摘:P窗C税R扩缓增有效势率n封:循封环密次域数5唐.删P垂C馒R产合量当E=1炎0耽0%,芳A异=形1时Y庄=窄2n>钞>矿2衰n(引窜物勇延轰伸柿产弯物班的毙量泽)7繁5P倘C截R烫t磁h淘e报r御m盾a茎l曾c键y课c遭l吴e纱rR代o车t道o掠r战-Gene7裹6P磨C桐R产被物塑的琼脂次糖县凝牢胶怪电歇泳骨分前析7颂7(浴二疮)前平端台巧期唐与已平盒台欧效誓应1传.平虫台摄效遍应(p帜l卧a阴t乡丰e昆a辆u窜e磁f向f雾e母c军t)族:P么C裳R经态过始一兔定海数挖量理的扩循死环折后储,D妈N陷A片橡段纹不鞭再君呈方指筒数慕累闯积岛,暗而蛛是舞进责入层静旗止胆期即碗平疲台湖期。7准8PCR平台效应7及92.平台期影响因素:①引物及dNTP底物浓度降低。②酶与模板比例下降。实际应用提示:定量PCR应考虑平台期效应,选择最适循环次数。8僚0二情、淋耐辉热D织N猫A聚贱合号酶(充三刮)历高内保扁真汤的喘耐躺热D罪N关A聚江合套酶(蛙二没)T睡a兰qD种N惊A聚老合梢酶(扒一略)P当C句R耐息热D愤N啄A聚岂合破酶蔽的程发姓现8陪1(一飘)P个C导R耐壤热D粗N漏A聚知合皇酶剧的底发少现2悼.T库4与T贼7务D亮N错A聚劣合昆酶:热册稳攻定侨性鸣差与。1杀.大丢肠偷杆盲菌D刊N该A聚父合伴酶ⅠK田l孕e佳n短o季w片久段:①热排稳昨定磨性堆差眯,锐不恶耐限高港温袭。②反择应驰温击度垒偏剂低舱,纵产钥生些非吩特里异丽扩棍增谎。3妈.T错a甜qD培N痕A聚酿合筝酶:实律现浓了P问C嚷R自素动斜化8赶2(旬二唇)T岸a阿qD曲N葡A聚壶合爪酶从驴嗜嘉热便水蚕生街菌t嘴h枯e超r塑m蚀u贤s敞a惑q乎u怀a枯t嘱i妻c库sY宏T司-轮1株制中肆直唉接共分越离移出腹来库。基桶因状全俯长:补2序,烧4范9倘6右b是p编必码堆蛋文白剑质:8导3脏2个A浸A伯,9慢4附k抛dC端桑结团构风域:5激′位→肉3悟′外行切待酶外活性N端泉结喉构拐域:聚犁合坡酶甲活蛾性HOOCNH28微31用.较留高嗓的解热驻稳唇定摧性●9茄5棉℃的押半娱衰柱期:4佣0薯m贤i视n●最福适漏温沾度:家7因2胸℃~8库0确℃●催亡化胖反碑应速减率:1艳5姑0~3痰0窜0核酸苷就酸/秒/酶哑分夹子8婆4T宜a己qD特N汪A聚虑合兔酶六特析性末:●5徒′脑→面3辩′聚田合槽酶象活蚕性棋;●5总′呢→抗3催′外枯切攀酶恐活套性零;●逆壁转长录刷酶洪活味性宝;●较壶弱孕的趴非得模圈板蛾依掏赖巧性喂;●缺堂乏3纲′户→狸5虚′外絮切烤酶鸽活晓性起。8拐52闯.无混机麻离户子随及师抑成制壳剂T浸a扛qD盾N炒A聚均合溜酶贼的仇活班性对M泥g2夺+浓渣度绍和辨单笋价娃离廊子绸(K+或N援H邀4+)挥的玻性斗质衣和脊浓绝度莲较俊敏制感神。最惯适M庆g2倾+浓检度:2欧m辞m对o讲l旗/拴LK+浓尝度:5佣0锄m贷m断o睬l煌/茂L8垄63魄.保刷真全性DNA聚合酶3′→5′外切酶活性核苷酸的错误掺入率T4DNA聚合酶+1/260000T7DNA聚合酶+1/190000Klenow片段±1/140000TaqDNA聚合酶-1/410008渴7如旦何鼓提趁高P止C带R丛D些N连A聚然合携酶后的昂保久真判性遵?①冶使通用T援a肥qD舍N煤A聚京合妻酶云时虾,掺蛇入闯少时量棋具滑有3孝′辜→潜5参′外屑切摩酶晃活密性群的堵耐讲热D探N杰A聚妹合洲酶,错店配谅率瘦可漏降渔为比原辽来伏的1没/般1愁0;②状使四陡种d悠N迅T弊P底晨物寨浓争度政相天等;③M查g披C毫l2浓盐度古尽耳可额能和低苍;④减播少判循蛾环臭数劫。8旋8(报三绘)恩几绿种钱高虹保联真料的冷耐拣热D尘N芽A聚柱合杠酶1泥.T利t惨hD殃N针A聚火合宵酶2玩.V焰e振n统tD双N煤A聚率合猴酶3串.P周f轧uD丸N红A聚座合估酶8拣9三钩、P幻玉C录R引趟物严及符设怒计度原业则(筛一惯)示引颂物蔑设拾计槐原箩则(佣二怖)取引缸物六用忍量续计感算9笛0(君一疑)娇引枣物痕设此计概原邪则引匀物序序申列模及罩其斯与扣模买板移特束异默性东结尺合是争决夕定P丢C挣R反锈应调结违果农的主关储键敌。9衬11.引灭物旁设榴计阔原净则:①引奴物绸长焦度:呜1酒0~3型0握N耻t②碱绑基贞分瓦布:纸A、T、G、C随座机盾分狭布③G须+公C含更量:4奴0~6垫0叉%T肉m瞎=拼4揪(近G京+雾C植)每+断2语(女A塔+还T咏)④引喷物谣之正间:芹避尝免3阔′端狼互步补9稀2⑤引歼物皱自漠身:宁不健应堪形票成甜二形级旧结都构⑦引泥物5汪′末萝端抖碱滴基:可华不医与帽模塘板D逆N量A互约补⑥引零物3峡′末升端前碱凳基:诵最蚂好敬选T、C、G,桌不飘选A9橡3引物5′端修饰技术附加核酸序列用途
限制酶位点克隆(如定向克隆)噬菌体启动子合成RNA探针、测序蛋白质结合序列产物纯化、检测核糖体结合序列高效表达加错配碱基造成突变定点诱变9讲42.简并引物(degenerateprimers):针对某一基因编码蛋白的氨基酸区域设计的一组碱基序列不同,但有相同碱基数的寡核苷酸混合物。9表5简绑并旧引摄物青设饭计练及应屈用搞:①筐对要纯宽化者的堪未锐知南蛋幸白耀测赴定校一研段嘉短氨盟基箱酸振序服列稳。②不趁同齐物吃种侄某厦一第基匙因全编后码驼的卡保吴守氨诊基槽酸桶区筝域收。应冠用:军基备于溪简希并铁引雀物P慈C悦R策梁略宏克扶隆新植基茎因9娇63冠.引婆物貌设咏计可缺烫陷醒而坝引乔起蚕的柳后浅果9斗74拥.优搂化救的弹引蛙物地设寸计醉实聚例上姻游幅引受物丈序竖列秧:5扔′G总A许G萝A桨A误C涝A朵T株G求G爷T振G妇C捏G墙C宽A蜂G携G兄T蛇T3洗′下徐游驰引射物委序棋列肃:5半′珍T斧G踢C呢C律C袋A令T珍C酸A讽T深C乌A恢T熊G在A味C录C此T晌G芒G3趁′9嗓85挎′C削A杏G木T貌T亏A均A迈G柳G太G市G侵G居C郊A押G莲G雅A头G敬T尊G念G郊C班G敌C男T风G猎C轧T番C牙A页C抗C饿T巴C众T绕G勒G要T早G尝C基C忧A烘A态A引G熄G冻G荣C专G篮G深C偏G全C廊A斤G规C塞G俯G惹C罪T免G吓C规C驾G触A罩G碰C购T克C蛋G躲G茎C靠C纵C当T乐G梁G护A怒G纲G搁C疗G文G屡CA案G忘A白A夸C答A垮T窃G滔G虫T值G故C蛙G切C迈A迟G形G颂T选TC属T缘瑞T坛G索G孕T流G乎A缩慧C馆C绢C坑T庄C困C问G旺G仆A裙T旦T促C查G留G狸C壤G番C烫G朗C现G辅T叉G某C晕G什G联C巧C唉C树G止C悦C察G案C微G德A恰G尝T逝G候A微G洋G另G助T摔T撤T霉T零C像G攻T摆G朋G膜T草T枣C狗A算C弟A旧T妄C闸C并C挨G解C川G污G列C湿T顽C谁A令C迷G吩G毛G搂G董G借A联G活T消G叨G辟G冰C兔A唉G拳C够G香C势C俗A气G利G店G店G护C距G踪蝶C农C束C猜G筐C考C阻G壳C巩T若G划T触G难G骆C搂C肉C惧T承C册G种T乞G守C完T帜G栋A旁T怨G甘C胶T慌A存C鼓T筋G功A惩G妹G客A赌G愉C德C唉A霉G邻C言G胖T湾C筋T绩A悉G毁G律G慰C即A象G盛C揭A滔G鉴C迎C肌G铁C辰T夏T判C阴C灶T归A牺G粗A到A钻G趣AC跳C浩A颠G岔G逢T千C贫A扁T浙G牙A龄T柜G禽A储T批G祥G浆G雾C父A回GC梯G忧C肉C摸C垒GG国G匀T鉴C副C万A日G目T览A颠C妙T株A完C润T划A植C冷C两C灵G军TA误G堪T迟G反G馋C粗G祸G着A抄G饱C叹T驾G烘C码T磨G殊C口T机G运C销T糟C共C蛇A敲C容G团G崭C忠G改C叙G涉G夫A离G随C吹C升C朋A汤A奇C时T六G阿C尝G关C娇C泰G肺A步C霜C渴C吹C3陈′9故91兰A2抬6其0o带l比i阁g着o润D脂N微A≈3流3苏μ救gN哄:引甚物碱壮基池数X:陪合捉成灿的o魂l怎i朝g胡o粘D攻N训AA2剧6边0单宫位Y:引祝物脊的p颂m脚o小l数1捧06Y(p膊m良o塔l)=狐X垂·棋3菊3耗×报─狠─3要3碌0悼.叛NX=─馅─煎×帽1躺05N(二)引目物蛋用罚量猎计念算1夏0苹0四笼、P惹C经R条棚件爹的鲁优巧化(一)T纯a赞qD加N析A聚化合敌酶塔浓简度域:1捞.皆0~2环.拐5首U椒/录1诉0大0展μ状l反驾应俱液(二)d皇N诱T心P浓贝度府:2梅0~2墨0洪0婆μ敬m愤o匆l摇/陡L(三)M化g2局+浓差度映:0爹.蠢5~2煎.耕5恭m稳m握o赢l括/咏L(四)引茄物潮浓坏度悲:0著.序1~0阔.冶5幸μ福m奴o振l什/隶L1穗0尚1P室C波R应冶用带举绘例①遗预传飞病诊匆断旦:凶镰混状勉细无胞虹贫仅血β爽6哈G堂l钱u废V异a租l(工G隐A专G塘G蒙U洁G逮)P观C齐R扩颜增β帅6唐D香N球A区丽域②传残染爪病诊末断盼:H偿B姐V和H箱I您V③肿蕉瘤邪分臣子农标馆志诊榆断:炉b苍c仁r槽-贴a矮b券lP蓝M疼L智/秃R旧A传R冬α④个院体师识钩别:亲胁子究鉴步定涝与艺刑套事易侦浙破⑤生动物考缴古1椒0游2五犬、P昨C售R改后进萄技脆术(绪一么)R残T繁-呜P携C或R(读r愈e包v炸e暖r即s途e摩t盾r被a伶n砍s页c唐r判i乌p丽t吵i傅o茧n庄P拾C援R猜)以m乏R扶N揭A为低模秤板伟逆梳转桥录递合李成c蒜D律N偶A,肾再僚以目此c爱D让N通A为课模男板药进宫行P微C中R反傲应。1慈0佩3RT-PCR原理1称0糠4逆手转翅录款酶①A砖M泽V(a熊v烟i廊a禽n丢m命y幕e身l跃o禁b焰l教a络s需t卡o灭s旨i喝s剧v漂i巧r乡丰u事s)酶纸活损性肚最抽适雾温掠度4因2剩℃②M弊M笔L休V(M形o饭l拾o缺n骨e方y馅m芒u哀r友i袖n隶e碰l落e腔u勉k监e配m浸i屑av舒i桂r苏u咽s)浓:奶最室适侮温萄度3惠7硬℃1始0碎5(野二疯)定帜量R阅T薄-型P朽C远R(Q趴R际T依-泪P鼓C泰R)P留C妈R扩奔增虑指比数角期旁内淘极棋小污的抵扩肿增绳效薄率沫改讽变诵会烟极畜大妙地您影惰响展产浊量敬。1绿.半荷定崭量R遥T蹄-波P党C法R以者样委本m摔R氏N丧A为脱模串板脂逆申转久录资合币成c野D泄N趣A,浓在上不柄同疗引桑物平对粘引获导阀下安共红同P牲C爹R扩天增“堆看律家届”留基丑因和目路的示基旁因c辱D麦N全A。1俩0右6①选差择抚内葵对戴照派基框因组娱织河中旁普今遍率表地达坡、呜表苹达移量寸比软较座恒拨定疫的枣“尖看莫家搏”认基煤因m筒R羞N介A。锤如G形A控P秃D背H和β拖-顶a俩c歼t柴i绣n计m寄R嫩N缠A等唉。②半辱定笔量城标义准计娘算P异C尖R产还物晃:靶c摔D救N漂A舰/液G里A每P筹D耗H违c绞D训N跃A1名0哨7R描T香-猎P积C葱R验局证G辈-较R种h芒2诱冤导T甚N皱F香α而m敌R徐N壳A表给达涌上药调25μmol/LG-Rh2
12h24h48h72h-+-+-+-+TNFαGAPDH③举捞例1拘0洋82旷.巾R骡e方a辆l获-方t贺i群m镇e宪R少T婶-尘P秘C港R原直理胖:P远C惭R体听系愿加再入铺一喉种双漫色与荧胳光胆标罪记捕的屿寡刊核适苷化酸粮探腿针,所根悦据返探弓针翻上邀荧摸光振信衫号敢的泄变立化蓝,症计款算群模孤板D哄N险A的袖含晚量温。1厕0雄9实殖时P拔C倡R应河用吗:用方于国基迎因D争N皱A拷园贝谜数腐和m正R免N妻A表扬达余定护量茫分援析质。1四1挤0定逢量谅检咐测P货C疾R产趋物长的奥指泪示垦系贴统:T烛a椅q范M友a酒n和M材o灵l闯e鞭c其u右l教a刊r蜜B由e气a四c械o乡丰n,林均即依贤赖荧勇光绸共但振母能太量穷转刊移(f售l峡u罗o兼r咬e桐s懒c肆e棍n苍c蚀e划r亚e茂s舌o容n氏a按n途c狼e崭e给n喇e怎r呜g祸y霉t营r喇a歇n碧s帐f揭e粮r,F腥R君E精T)丽。1梨1爪1①T储a班q黄M镇a壁n爽P谜r陶o债b甲e●寡把核挪苷益酸舰探钱针的5扔′端吉标较记聋一欠个没报鸽告均荧厕光凡染嫁料代(r熊e枣p例o醋r榆t伙e料r碑f拼l游u匠o目r庭e皂s旅c惨e度n尿c辅e什d章y览e)场,3鹊′端须标袍记陷一仍个授淬糟灭站染圣料绝(q捉u猴e球n喊c吐h中e巧r血d幅y宽e)慢。1聋1欲2●当棕光魂源尼照杜射棍到销探袖针亭时效,买被激吨发挪的超报启告拜荧磁光磁染贪料将挤能爽量晴转钉移停给嫂附萄近虚的淬爬灭壳染肢料而零不皂发跑光婆。1赤1拢31互1呆4RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双并标念记坏探睛针候(T恩a璃q情m毫a龟n珠P凡r叛o胡b唐e)5建′5勤′5垂′3读′3墙′1换1复5●当P嚼C哈R扩闪增分时拳,T库a斜qD抱N遥A聚织合替酶牧遇
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