反胶团萃取教学课件

反胶团萃取36、如果我们国家的法律中只有某种神灵，而不是殚精竭虑将神灵揉进宪法，总体上来说，法律就会更好。——马克·吐温37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之时。——威·皮物特38、若是没有公众舆论的支持，法律是丝毫没有力量的。——菲力普斯39、一个判例造出另一个判例，它们迅速累聚，进而变成法律。——朱尼厄斯40、人类法律，事物有规律，这是不容忽视的。——爱献生反胶团萃取反胶团萃取36、如果我们国家的法律中只有某种神灵，而不是殚精竭虑将神灵揉进宪法，总体上来说，法律就会更好。——马克·吐温37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之时。——威·皮物特38、若是没有公众舆论的支持，法律是丝毫没有力量的。——菲力普斯39、一个判例造出另一个判例，它们迅速累聚，进而变成法律。——朱尼厄斯40、人类法律，事物有规律，这是不容忽视的。——爱献生反胶团萃取技术反胶团萃取技术的产生传统的分离方法，如液-液萃取技术很难应用于对生化产品（如蛋白质、氨基酸、抗生素等）的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活；而盐析、沉淀、层析、电泳等生化分离方法又不能实现连续和放大操作。因此，针对这两大难题，在20世纪70年代中期反胶团萃取技术就发展起来了。一、概述反胶团萃取技术反胶团萃取技术的产生

传统的分离方法，如液-液萃取技术很难应用于对生化产品（如蛋白质、氨基酸、抗生素等）的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活；而盐析、沉淀、层析、电泳等生化分离方法又不能实现连续和放大操作。因此，针对这两大难题，在20世纪70年代中期反胶团萃取技术就发展起来了。一、概述反胶团的突出优点

(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性;(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便;(3)能解决蛋白质

(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题;

(4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶;(5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。2.1胶团和反胶团的形成

胶团或反胶团的形成均是表面活性剂分子自聚集的结果，是热力学稳定体系。（1）正向微胶团:

在水溶液中形成的胶体或微胶团，是由于表面活性剂中极性基团定向排列的结果。§２反胶团的形成及特性极性“头”水非极性的“核”非极性“尾”

表面活性剂的极性头部（亲水基）朝外（水）

，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”。这种胶团称为正向胶团，或简称正胶团。胶团的形成胶团（2）反相胶团

如果溶剂为非极性液体，当加入表面活性剂至一定浓度时，由于表面活性剂的极性和非极性基团的定向排列，也会形成微胶团结构。极性“头”有机溶剂极性的“核”非极性“尾”反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”。反胶团的形成反微团内溶解的水称为微水相或水池反胶团是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。2.2常用的表面活性剂

可在非极性溶剂中形成反胶团。在用反胶团萃取技术分离蛋白质的研究中使用得最多的是阴离子型表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名称是丁二酸二异辛酯磺酸钠。丁二酸二异辛酯磺酸钠这种表面恬性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小，形成反胶团时不需加入助表面活性剂，并且形成的反胶团较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。溶剂

通常为异辛烷(2，2，4-三甲基戊烷)AOT能溶解于有机溶剂中，也能溶解于水中，并形成反相微胶团。AOT在形成反胶团时的Wo值较大，可达170。因此在反相微胶团内就可以溶解较多的生物大分子而提高了萃取效率。2.3反胶团的两个特异性功能

(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能;(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。2.4反胶团的形状和大小

反胶团的形状多为球形或近似球形，有时也呈柱状结构，其半径一般为10～100nm。胶团的大小取决于盐的种类和浓度、溶剂和表面活性剂的种类和浓度以及温度等。2.5Wo值

表征胶团大小较好的参数是Wo——水与表面活性剂的摩尔比。用非极性溶剂中的水浓度和表面活性剂浓度之比来表示:

Wo=[H20]/[表面活性剂]Wo值的物理意义

Wo值越大，反相微胶团内的水分含量就越多，形成的反相微胶团的半径就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此，Wo值大小可以反映出反相微胶团的大小和溶解能力。2.6CMC

表面活性剂的临界浓度：

表面活性剂要形成反相微胶团，在溶剂中的浓度必须达到一定值，否则就不能形成微胶团，这个形成微胶团所必需的最低浓度值，叫做表面活性剂形成微胶团的临界浓度(CMC)。

不同的表面活性剂的CMC值在0.l-1.0mmol/L之间，随温度、压力和溶剂的变化而变化。2.7水池的性质

表面活性剂分子的聚集使反胶团内形成极性核，反胶团内溶解的水通常称为微水相或“水池”。由于反胶团内存在“水池”，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供适宜存在的亲水微环境。因此，“水池”的物理化学性质直接影响到反胶团萃取的适用范围和效率。当反胶团的含水率较低时，反胶团“水池”内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，以AOT为表面活性剂，当wo小于6～8时，反胶团内微水相的水分子受表面活性剂亲水基团的强烈束缚，表观黏度上升50倍，疏水性也极高。随着wo的增大，这些现象逐渐减弱，当wo大于16时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层。

即使当wo值很大时，“水池”内水的理化性质也不可能与正常的水完全相同，特别是接近表面活性剂亲水头的区域内。反胶团内的水由于表面活性剂分子极性头电离具有很高的电荷浓度，因此“水池”中水的pH值不同于主体水的pH值。

这一结论对于在反胶团内固定蛋白质的研究尤为重要。§3反胶团萃取蛋白质的过程

蛋白质进入反胶团溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶团，此反胶团扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件(如pH值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程生物大分子反胶团形成的方法最常用到的有3种:（1）注入法（2）转移法（3）溶解法（1）注入法

通过将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性剂的有机相中，从而实现萃取过程。（2）相转移法

通过将含生物大分子的水相与溶解有表面活性剂的有机相接触，缓慢地搅拌，在形成反向微胶团的同时，其中的生物大分子即转入到反相微胶团中，直到处于萃取平衡状态为止。（3）溶解法

对于固体粉末中含有的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法进行。3.1蛋白质溶入反胶团的推动力

蛋白质溶解于反胶团的主要推动力是表面活性剂与蛋白质的静电相互作用。此外，反胶团与蛋白质等生物分子间的空间相互作用对蛋白质的溶解率也有重要影响。3.1.1静电作用力

在反胶团萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用是萃取过程中的一种主要推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷，这与蛋白质等电点pI有关。即随着pH值的改变，被萃取蛋白质所带电荷的性质和带电量是不同的。

对于阳离子表面活性剂形成的反胶团体系，萃取只发生在水溶液的pH>pI时，此时蛋白质与表面活性剂极性头问相互吸引；

pH<pI时，静电排斥力将抑制蛋白质的萃取。对于阴离子表面活性剂形成的反胶团体系，情况正好相反。3.1.2空间位阻效应

反胶团“水池”的物理性能(大小、形状等)及其中水的活度是可以用Wo的变化来调节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。许多反胶团萃取的实验研究已经表明，随着Wo的降低，反胶团直径减小，空间位阻作用增大．蛋白质的萃取率也减少。空间位阻效应也体现在蛋白质分子大小对分配系数的影响上。在各种蛋白质等电点处的反胶团萃取实验研究表明，随着蛋白质分于量的增大，蛋白质的分配系数(溶解率)下降。当相对分子质量超过20000时，分配系数很小。该实验在蛋白质等电点处进行，排除了静电相互作用的影响，表明随分子量增加，空间位阻作用增大，蛋白质萃取率下降。因此，也可以根据分子量的差异利用反胶团萃取实现蛋白质选择性分离。3.2影响反胶团萃取蛋白质的主要因素

由上述分析可知，任何可以增加蛋白质与反胶团的静电作用或导致形成较大反胶团的因素，都有助于蛋白质的萃取。影响反胶团萃取蛋白质的主要因素，见表2-10。只要通过对这些因索进行系统的研究，确定最佳操作条件，就能得到合适的目标蛋白质萃取率。从而达到分离纯化的目的。(1)水相pH值的影响

水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态，从而对萃取过程造成影响。当蛋白质所带的电荷与反胶团内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质溶于反胶团中。(2)离子的种类和强度的影响

与反胶团相接触的水溶液离子强度以几种不同方式影响着蛋白质的分配。①离子强度增大后，反胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度。②反胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶团变小，从而使蛋白质不能进入其中。

③离子强度增加时，增大了离子向反胶团内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，蛋白质从反胶团内再被盐析出来。④盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能．盐的浓度越高，其影响就越大。阳离子的种类对萃取率的影响

如Mg2+、Na+、Ca2+、K+对萃取率的影响主要体现在改变反胶团内表面的电荷密度上。通常反胶团中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相反离子缔合)。极性基团的电离程度愈大，反胶用内表面的电荷密度愈大，产生的反胶团也愈大。表面活性剂电离的程度与离子种类有关。同一离子强度下的四种离子对反胶团的Wo的影响见表2-11。由表211-可知，极性基团的电荷密度按K+

、Ca2+、Na+、Mg2+的顺序逐渐增大，电离程度也相应的增大。(3)表面活性剂的种类和浓度的影响

阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可用于形成反胶团，关键是应从反胶团萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂。除此以外，还应考虑形成反胶团及使反胶团变大(由于蛋白质的进入)所需的能量的大小以及反胶团内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响。

增大表面活性剂的浓度可增加反胶团的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓度。(4)溶剂体系的影响

溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有很大的影响，常用的溶剂有烷烃类(正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等。有时也添加助溶剂，如醇类(正丁醇等)来调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。§4反胶团萃取的过程及工艺开发4.1反胶团萃取过程水相中的溶质进入反胶团相需经历三步传质过程：①通过表面液膜从水相到达相界面；

②在界面处溶质进入反胶团中