微生物的纯培养和显微技术课件

第二章微生物的纯培养和显微技术1、本章学时数：3学时2、教学目的与要求：通过本章的课堂教学，向学生介绍进行微生物学研究的基本技术，即无菌技术、纯种分离技术、培养技术和显微技术，使他们了解微生物学的基本研究方法和研究手段，为后面介绍其他微生物学相关知识打下基础。3、教学重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。4、教学难点：微生物的分离和纯培养技术（如选择培养），为了解决难点内容的教学问题，拟采用：多媒体动画的形象教学。5、要求阅读的文献资料：⑴《微生物学教程》，周德庆，高等教育出版社，1993

⑵

“Brock'sBiologyofMicroorganism9TH”，MichaelT.MadiganJohnM.MartinkoJackParker，PrenticeHall，1999

⑶

“Microbiology”，LansingM.Prescott,DonaldKlein,JohnHarley，McGraw-HillHigherEducation，2002及其中译本“微生物学”，沈萍、彭珍荣主译，高等教育出版社，2003第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术1、微生物培养的常用器具及其灭菌:最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌左图是高压蒸汽灭菌锅注意事项：排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。2、接种操作

无菌操作箱及其操作二、用固体培养基获得纯培养铜绿假单孢菌的菌落特征弗氏志贺氏菌的菌落特征粘质沙雷氏菌的菌落特征细菌的菌落：单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。可作为鉴定细菌种的依据。沙门氏菌的菌落特征霉菌的菌落霉菌的菌落霉菌的菌落霉菌的菌落1、平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造成机械损伤Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.2、稀释倒平板法3、平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。

分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.4、稀释摇管法（厌氧培养法）

高层琼脂柱.....................

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<>厌氧罐anaerobicjar首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.三、用液体培养获得纯培养四、单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。用途：高度专业化的开学研究五、选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。＊1、利用选择培养基进行直接分离＊2、富集培养＊利用选择培养基进行直接分离根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。＊富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后在进行培养。1、选择培养基分离法1.dilutesample1ml9ml10

1001000104105

106107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基2、富集培养六、微生物的保藏技术：

目的：

①存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种

原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）

菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上微生物菌种保藏的方法1、传代培养保藏方法：（琼脂斜面、半固体、液体）

①低温保藏法

方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代

原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。

②石蜡油低温保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。

2、冷冻保藏——低于－70℃③液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。或低温冰箱适用于各种微生物的较理想的保藏方法

3、干燥保藏法④真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。⑤干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。干法保藏菌种的方法 滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体有机基质（曲料、麦粒）滤纸片薄片状载体明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（…乙烯薄膜…）

几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便有效简便有效菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：

中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)

美国的典型菌种保藏中心(ATCC)

英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：一显微镜的种类及原理普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（如下图）；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），

1933年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。

用电子束作光源，用电磁场作透镜,由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。透射电子显微镜工作示意图（左）和照片（右）

扫描电子显微镜

人类血细胞SEM照片

二、显微观察样品的制备1、光学显微镜的制片：活体（压滴法）；染色涂片干燥固定染色1min水洗、吸干镜检简单染色制备涂片标本→染色2、电子显微镜的制片透射电镜的样品制备⑴负染技术

负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果分辨力可达1.5nm左右。⑵投影技术见P28⑶超薄切片

通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片（图2-13），切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差。扫描电镜样品的制备：标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

扫描电镜工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。第三节显微镜下的微生物一、细菌和古细菌1、细菌的形态和排列球状杆状螺旋状基本形态1、球菌细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。单球菌：细胞分裂沿一个平面进行，新个体分散而单独存在.如尿素微球菌(Micrococcusureae)双球菌：细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列.

如肺炎双球菌(Diplococcus

pneumoniae)链球菌：细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状.如：乳链球菌（Streptococcuslactis）无乳链球菌（Streptococcusagalactiae)溶血链球菌（Streptococcushemolyticus)四联球菌：细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，呈田字形.

如四联微球菌（Micrococcustetragenus）八叠球菌：细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起成立方体形.

如藤黄八叠球菌（Sarcina

ureae)葡萄球菌：细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群体，犹如一串葡萄。如：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)白色葡萄球菌（Staphylcoccus

albus)2、杆菌细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。杆菌(bacillus)及其排列状态杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、“八”字状等。短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌3、螺形菌弧菌螺旋菌螺旋体菌螺旋菌(spirilla)螺旋状的细菌称为螺旋菌。

根据其弯曲情况分为：

弧菌（vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形

例：霍乱弧菌、逗号弧菌

螺旋菌(spirillum)：螺旋满2—6环，螺旋状

例：干酪螺菌

螺旋体(spirochaeta)：旋转周数在6环以上，菌体柔软。

例：梅毒密螺旋体Vibrio

cholerae柄细菌的特征形态电镜照片。a）双鞘不粘杆菌；b）游离臂微菌；c）普氏绿臂菌；d）柄杆菌鞘衣菌Sphaerotilus

natans（a）相差显微镜照片（b）透射电镜超薄切片

a）星形细菌（Stella，astar-shapedbacterium）；b）方形细菌（square-shapedbacteria）。左为模式图，右为照片

Actinomycetes是一类具有丝状分枝的单细胞，主要以外生孢子的形式繁殖，革兰氏阳性，与细菌同属原核微生物。放线菌菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状呈放射状生长，并因此而得名。放线菌有特殊的土霉味。分布：含水量较低、有机物丰富、呈微碱性的土壤中。估计每克土壤中约含放线菌孢子107个。应用：放线菌对人类最突出的贡献就是它能产生大量的、种类繁多的抗菌素。放线菌还是酶类、维生素的生产菌；有的放线菌有固氮能力；放线菌在自然界物质循环中也起着重要作用，由于它们具有较强的分解复杂有机物的能力，对于土壤肥力的提高也有重要作用。危害：只有极少数放线菌对人类构成危害，某些Actinomyces（放线菌属）菌种引起动物放线菌病（皮肤、脑、肺和足部感染），某些Nocardia（诺卡氏菌属）引起人和动物的诺卡氏菌病；还有少数放线菌能引起植物病害。放线菌概述放线菌与细菌的比较同为单细胞，菌丝比真菌细，其直径与细菌接近；同属原核生物。无核膜、核仁和线粒体等。核糖体70S等；胞壁含磷壁酸，二氨基庚二酸，不含几丁质，纤维素；G+;对环境的要求与细菌相近；对溶菌酶敏感；对抗生素的反应向细菌。总之，放线菌是一类介于细菌和真菌之间，而更接近于细菌的原核生物。所以：在Bergey’sManualofSystematicBacteriology.Vol.4上归在分枝菌纲(Actinomycetes)1、营养菌丝匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无隔膜，直径0.2-0.8mm，长度差别很大，有的可产生色素。2、气生菌丝营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养菌丝上，可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深，直径较粗（1-1.4mm），有的产色素。3、孢子丝气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。其形状和排列方式因种而异，常被作为对放线菌进行分类的依据。放线菌孢子丝类型：二级轮生一级轮生丛生松螺旋紧螺旋钩状放线菌的繁殖方式放线菌的生活史支原体形态（丝状支原体的电镜照片，注意球状和丝状体）

从热泉中分离的火山热原体细胞电镜照片（投影技术）

深层地表中的产甲烷菌三角形和方形古生菌隐蔽热网菌a）暗视野下的形态；b）电镜超薄切片。该菌不同细胞的直径差异范围可达0.3-2.5mm不规则形状的古生菌细菌细胞的大小大小范围最小：与无细胞结构的病毒相仿（50nm；）最大：肉眼可见（0.75mm）；微生物个体大小衡量单位

细胞mm（=10-6m）

病毒mm（=10-9m）费氏刺骨鱼菌(0.08mmx0.6mm)(Epulopiscium

fishelsoni)比大肠杆菌大100万倍（1985年发现）德国科学家H.N.Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌（sulfurbacterium），其大小可达0.75mm，Thiomargarita

namibiensis，---------“纳米比亚硫磺珍珠”（nanobacteria）（50nm）最大和最小细菌的个体大小悬殊：（Thiomargaritanamibiensis）（0.75mm）15000倍不同细菌大小比较细菌大小测量结果的影响因素个体差异；干燥、固定后的菌体会一般由于脱水而比活菌体缩短1/3-1/4；染色方法的影响，一般用负染色法观察的菌体较大；幼龄细菌一般比成熟的或老龄的细菌大；环境条件，如培养基中渗透压的改变也会导致细胞大小的变化。二、真菌真核生物：是一大类细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的生物称真核生物。真核生物的特征：细胞核有核膜；细胞质中有多种细胞器；能进行有丝分裂。微生物中的真核生物，即为真核微生物即具有上述特征的微小生物菌物界真菌假菌粘菌单细胞真菌－酵母菌丝状真菌－霉菌大型真菌－蕈菌1、丝状真菌——霉菌霉菌（mold）是丝状真菌的一个俗称，通常指那些菌丝体较为发达又不产生大型肉质子实体结构的真菌。⑴、分布及与人类的关系①工业上的有机酸、酶制剂抗生素、维生素、生物碱等的发酵生产②进行生物防治，污水处理和生物测定③食品制造方面，如酱油的酿造和干酪的制造④在基础理论研究方面，霉菌是良好的实验材料2、霉菌的形态结构

霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝（hyphae)构成。菌丝是真菌营养体的基本单位。

菌丝是中空管状结构，直径一般3～10μm，有分枝，有隔膜或无隔膜。根据菌丝有无隔膜，可以将真菌分成低等真菌（鞭毛菌亚门和接合菌亚门）和高等真菌（子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门）两大类。

许多菌丝分枝连接，相互交织在一起所构成的形态称菌丝体（mycelium)。菌丝体及其各种分化形式由许多菌丝相互交织而成的一个菌丝集团称菌丝体营养菌丝体——密布在固体营养基质内部，主要执行吸收营养物功能的菌丝体

气生菌丝体——伸展到空间的菌丝体

这两类菌丝体在长期的进化中，因其自身的生理功能和对不同环境的高度适应，已明显地发展出各种特化的构造。（2）匍匐菌丝：毛霉目真菌在固体基质上常形成与表面平行、具有延伸功能的菌丝，又