分子生物学技术6

第六章分子生物学技术

生化技术

电泳层析离心分光光度基因操作其它基因工程

分切接转筛表

电泳层析离心分光光度基因操作其它

分（离目的基因）切（割目的基因和载体）

接（连目的基因和载体）

转（化宿主细胞）

筛（选阳性克隆）表（达目的基因）基本模式“纵向”体系“横向”体系第一节核酸及蛋白质操作技术DNA操作技术RNA操作技术蛋白质操作技术DNA操作技术DNA的分离DNA的纯化DNA的鉴定DNA的扩增及基因文库的构建RNA操作技术RNA的分离RNA的纯化RNA的鉴定cDNA的扩增及cDNA文库构建一、核酸操作技术（一）核酸的分离与纯化基本原则：1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。核酸提取的主要步骤来源：细胞（包括培养细胞）、病毒温和裂解，溶解核酸，使核酸与蛋白（组蛋白）分离；采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。生物样本（细胞、病毒）破碎分离

纯化质量测定保存核酸的贮存核酸分离提取的基本步骤Step1Step2Step3Step4细胞的破碎：物理方法溶胀和自溶化学方法生物酶降解核酸的纯化核酸的浓缩和沉淀抑制RNase活性是提取RNA的关键在实验中，严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。RNA操作中的要求防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。RNA的分离和纯化-TRIzol试剂法原理：首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，RNA存在于水相。经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等；存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。（二）、核酸的鉴定

1、核酸分子杂交鉴定（1）核酸分子杂交的基本原理（见第二章）

（2）影响杂交的因素a.核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂交效率b.温度：DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃c.离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度

d.甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交

e.核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性f.非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉

（3)、核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交

液相杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法

斑点及狭缝印迹杂交斑点印迹为圆形狭缝印迹为线状鉴别DNA、RNA简单、快速，同一张膜可检测多个样品特异性不高、不能鉴别核酸分子量固液杂交

膜上印迹杂交Southern和Northern杂交（略）原位杂交定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交固液杂交保持组织细胞的形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落（3）探针的选择与标记以获得最好杂交效果为依据选择探针探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察（4）杂交杂交液体积小：10~20μlcDNA和RNA探针杂交温度约为50℃杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜杂交前一般将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性冲洗温度一般不超过50℃（5）杂交结果检测所用探针为核素标记,放射自显影检测所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测检测目标菌落的杂交技术菌落杂交原位杂交液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。A、RNA酶保护分析法a.RNA酶保护分析法原理RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。b.杂交过程制备待测RNARNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标记RNA探针杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交RNaseA和RNaseTI除去单链RNA电泳分离RNA放射自显性检测杂交结果B、核酸酶S1保护分析法a.原理核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法b.杂交过程制备待测RNA：总RNA或mRNA均可单链DNA探针的制备与标记杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA电泳分离DNA/RNA杂交体分子放射自显影检测杂交结果

（4）探针的标记a.探针的种类核酸探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；非放射性的探针又分为荧光探针、DNA半抗原标记探针、光敏生物素标记探针以及酶标记的探针（要结合底物显色）等；根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针及寡核苷酸探针等几类。

b.标记物理想标记物应具备以下特性：高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性标记物种类：

核素标记物：32p、35s、3H非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光

c.标记方法

体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中

体外标记法：

化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法切口平移法（nicktranslation)①利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口②利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除③在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中随机引物法

其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中d.探针的纯化乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-50微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针(5)分子杂交技术的应用分子杂交技术不仅广泛应用于科学研究方面，而且还主要用于遗传性疾病的诊断，如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断等方面；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；分子杂交技术也是诊断外源性病原体，如病毒、细菌、原虫等导致的疾病最常用的检测手段。在法医检测中分子杂交技术应用于有关性别鉴别和DNA指纹谱的鉴定。可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。2、DNA测序鉴定通过对DNA测序，利用序列分析来确定该DNA分子是否为目标分子。核酸测序Sanger的酶学测序原理Gilbert的化学测序法自动测序仪的发明3、其他方法鉴定PCR扩增RT-PCR扩增荧光定量PCR扩增（三）核酸的扩增1、DNA的体内扩增质粒在宿主细胞内的复制2、DNA的体外扩增PCR扩增（相应的PCR扩增技术）基因体外扩增——PCR技术1、基因扩增原理条件靶DNA的扩增(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。典型的PCR反应条件典型的PCR循环程序*在PCR中，为了使先前扩增而尚未完成的产物能完成扩增常进行此循环PCR中所用的一些DNA聚合酶TaqDNA聚合酶的特性引物设计的原则

——可采用primier5orOligo6软件设计①引物的长度通常在15～30个核苷酸之间。引物越长，特异性越高，合成的成本也越高。常见的引物长度在20个碱基左右。②G/C含量引物的G/C含量一般在50％左右，G/C含量高，引物容易与模板结合，但如果过高，引物和模板结合过于紧密，会影响变性。G/C含量低，引物与模板不易结合。③引物二聚体在引物中不应出现④发夹结构在引物中不应出现⑤结合位点引物在目的DNA应该只存在一个结合位点，如果有多个结合位点，扩增时会出现非特异性扩增产物。⑥引物的3端最好以G/C结束有利于延伸的正确进行。问题：设计PCR上下游引物时应该注意的问题（2010南京大学考研题）

2、

PCR的主要用途①目的基因的克隆②基因的体外突变③DNA和RNA的微量分析④DNA序列测定⑤基因突变分析3、几种重要的PCR衍生技术①反转录PCR技术②原位PCR技术③实时PCR技术原位PCR(In-situPCR)实时PCR技术原理原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。（四）、文库的构建采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体DNA切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组DNA的集合即称为基因组文库。以细胞mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应cDNA的大量克隆，这些克隆就构成了cDNA文库。1、基因组文库和cDNA文库2、人工染色体构建

1983年，美国的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章，报道了构建YAC（YeastArtificialChromosome）库的过程。1987年，Burke等人发现，仅仅带有ARS序列的载体虽然能够被复制，但极易在有丝分裂时丢失。即使在选择培养基上，也只有5%-20%的子代细胞带有ARS载体。加入Centromeres（CEN）能显著提高ARS质粒在有丝分裂时的稳定性，90%以上子代细胞带有该载体。CEN还能显著降低拷贝数，从20-50/细胞降为1-2/细胞。（Science,236:806-812）。人工染色体含有三种必需成分：着丝粒、端粒和复制起点。

着丝粒(CEN)位于染色体中央，呈纽扣状结构，在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动，也是姐妹染色单体配对时的最后位点，接收细胞信号而使姐妹染色体分开。

端粒（TEL）：主要功能是防止染色体融合、降解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模板，在染色体端部添加上端粒重复序列，并参与端粒长度和细胞增殖的调控。

复制起点：DNA复制通常由起始蛋白与特定的DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同一段长约100bp的DNA上。YAC的主要缺点

1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；

2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；

3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。

4．操作时容易发生染色体机械切割。以细

菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，又易于分离。科学家用"染色体建造"法用F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。该质粒主要包括oriS，repE（控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分。BAC的优点

1．易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）；

2．超螺旋环状载体，易于操作；

3．F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；

4．很少发生体内重排。

有人把人类染色体端粒DNA上单个α-卫星DNA单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因组DNA混合，产生了能被复制、能正常分裂并得到长期稳定保存的人工合成的染色体，长度约为6-10Mb，称为MAC或HAC。

细胞破碎离心电泳（SDS、双向电泳、脉冲电泳等）分离及纯化蛋白质的分离纯化蛋白质鉴定蛋白质保存蛋白质鉴定：分子大小——电泳比对、质谱分析结构鉴定——X射线、MNR抗原性鉴定、活性鉴定蛋白质保存：真空干燥——干粉冷冻抽干——冻干粉二、蛋白质操作技术第二节生物大分子互作研究技术在分子生物学研究中，除了利用核酸分子间的杂交技术外，还利用核酸与蛋白质之间，甚至蛋白质与蛋白质之间的杂交技术来研究生物大分子之间的相互作用。现简介如下：一、DNA-蛋白质相互作用研究技术（一）凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）

又叫DNA迁移率变动实验（DNAmobilityshiftassay），是上世纪80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

凝胶阻滞实验的基本原理（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀法（chromatinimmuno-precitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。染色质免疫沉淀法的基本原理（三）DNaseⅠ足迹实验（footprintingassay）

是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。32p1510*14810*加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510AB足迹(a)(c)(b)DNaseI足迹实验（四）甲基化干扰实验（methyltioninterferenceassay）根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。

GGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGGGⅢmDNA局部甲基化与蛋白质提取物混合与蛋白质结合不与蛋白质结合与蛋白质结合凝胶电泳与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段切除所有结合有蛋白质但与蛋白质不结合的DNA区带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基结合带非结合带缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护甲基化干扰实验二、RNA干扰技术（RNAinterference，RNAi）RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象.它是一种跨越多种种属的古老的生物途径,同时它的出现为生物学家提供了一种快速、简便的反向遗传学技术,在后基因组时代功能基因的研究中具有重要的应用前景.（一）RNAi的发现1990年,为加深矮牵牛花(petunias)的紫色,Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因。结果许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。P35S色素基因Ti质粒＋色素基因重组转化繁殖1998年,AndrewFire等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的研究证明,在正义RNA阻断基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)。他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于转录之后,所以又称RNAi为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现,21～25nt的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。Hammond等进行的细胞提取物核酸酶活性实验，证明了这些小分子双链RNA（siRNA）在RNAi中的作用。随后人们陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人体内发现了RNAi现象。（二）RNAi的作用原理双链RNA（dsRNA）(外源的或体内产生的)首先被降解为具5’单磷酸、长21～23bp的小分子双链RNA,这种RNA小分子称为小干扰RNA（SmallInterferingRNA，siRNA）。siRNA具相似的结构特征:为长约21～23bp的双链RNA,具5’单磷酸和3’羟基末端,互补双链的3’端均有一个2～3nt的单链突出。1.siRNA的产生一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA转化为siRNA。它属于RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。Dicers2.siRNA介导mRNA降解siRNA形成之后,与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),在ATP存在下，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA并使其降解,从而导致特定基因沉默。3.RNAi的特异性和高效性许多研究显示RNAi过程中有新的dsRNA分子的合成。当siRNA反义链识别并结合靶mRNA后,siRNA反义链可作为引物,以靶mRNA为模板在依赖于RNA的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割产生新的siRNA,新siRNA再去识别新一组mRNA,又产生新的siRNA,经过若干次合成2切割循环,沉默信号就会不断放大。CapAAAAAACapAAAAAACapAAAAAA循环复制酶Dicer切割

（三）RNAi的生物学功能通过组蛋白甲基化影响染色质结构:Volpe等（2002）的研究表明，至少在裂殖酵母中,RNAi机制可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。通过DNA甲基化在转录水平调节基因表达对RNAi相关基因。在翻译水平调节机体发育。作为基因组的免疫系统。研究表明RNAi机制在真核细胞中起着类似动物免疫系统的作用,充当基因组的防护者。（四）RNAi技术的应用基因功能研究：利用RNAi技术使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关。Chiou-FenChuangandElliotM.Meyerowitz*PNAS

April25,2000vol.97

No.9

4985–4990（四）RNAi技术的应用2.临床应用：RNAi机制可作为真核生物的基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因的表达。

★利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖,这为病毒相关疾病的治疗提供了新的思路。

★利用RNAi技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。TheHumanImmunodeficiencyVirus(HIV)LifeCycleandRNAInterference.

NEnglJMed,Vol.347,No.17·October24,2002GALUAS

minimalpromoter

Reportergenes(transcriptionADBaitproteinLibraryproteinThetwohybridprinciple

DNA-BD（一）酵母双杂交系统酵母双杂交系统是检测蛋白与蛋白相互作用的遗传分析实验，即检测蛋白质相互作用的实验。三、蛋白质相互作用研究技术1．酵母双杂交系统的基本原理

酵母双杂交系统的建立是基于对酵母转录激活因子GAL4分子的研究。如果将GAL4分子的DNA结合区（bindingdomain，BD）和促进转录的活化结构域（activationdomain，AD）分开，两者不能表现出对下游基因表达的激活作用。如果BD和AD分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。

2、模型3、报告基因LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)4、假阳性的问题假阳性是酵母双杂交系统的最大问题假阳性通常由以下原因造成:prey蛋白的非特异性结合无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因） 5、酵母双杂交的优点

快速获得相互作用蛋白的基因只需单一步骤的质粒构建在体内鉴定蛋白的相互作用弱小的，暂时的相互作用也能鉴定能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号6、酵母双杂交系统应用（1）分析已知蛋白质之间的相互作用

（2）对蛋白质功能域的分析

（3）分析未知蛋白质相互作用（4）绘制蛋白质相互作用系统图谱（5）在药物设计中的应用酵母双杂交应用举例蛋白级联底物的鉴定钙调蛋白与L-异天冬氨酰甲基转移酶的相互作用E2F1突变子的遗传特性多肽荷尔蒙受体相互作用Pha-4在线虫C.elegans中的相互作用（二）噬菌体展示技术噬菌体展示（phagedisplay

）技术是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面的技术。通过与特定的靶标反应（如抗体、受体、配基、核酸、以及某些碳水化合物等）可以使展示特定蛋白的噬菌体从表达有各种外源性蛋白的噬菌体肽库中筛选出来，再通过感染大肠杆菌使选择出来的噬菌体扩增，然后进行序列测定，可获得相应的结构和功能信息。3种常用于表面展示的噬菌体为M13,F1,FD利用病毒粒子表面蛋白构建多肽文库，每个噬菌体能展示一个任意的多肽SolidphaseselectionwithimmunotubesImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBBBBBBBvvbiotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigenBindtoStreptavidincoatedmicrotitrewells通过噬菌体表面展示的蛋白可以与其靶蛋白相互作用，无论靶蛋白是抗原，蛋白或者病原，都可以快速有效地处理并用于筛选去除未结合的噬菌体病毒粒子，洗脱结合的噬菌体.可进一步扩增纯化的噬菌体，重复筛选或进行如下分析：a)ELISA；b)Specificity；c)Sequencing；d)Affinity；e)Activity。最终获得目标产物。可用上述方式构建噬菌体抗体片段库，用于抗体筛选等研究。

免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。（三）免疫共沉淀技术是一种直接检测蛋白与蛋白相互作用的方法。（四）免疫印记技术Westernblot

isamethodfor

identifyingaspecificprotein

inacomplexmixtureandsimultaneouslydeterminingitsmolecularweight.Thenamecameaboutthisway:DNAblotwasfirstdescribedbyE.M.Southernand,hence,becameSouthernblot.RNAblottingthenwasdubbedNorthernblot.Thus,itwasinevitablethatproteinblotwouldbecomeWesternblot.Theprocedurecanbebrokendownintoaseriesofsteps.

提取蛋白质；SDS电泳分离蛋白；转膜；抗体免疫；洗脱；显色或自显影；曝光检测。Westernblotting主要步骤:

AB971166620043312123ManyproteinsarepresentintheCoomassieblue-stainedgel(A);Atypicalblotoverlayexperimenttodetectproteinbindingpartners.四、生物芯片技术BiologicalChipTechnology（一）基因芯片（genechip）DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)目录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。（二)蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)【思考题】1．分子印迹与杂交技术的主要方法有哪些？2．PCR技术的基本原理和基本过程是什么？其主要用途有哪些？3．基因组DNA文库与cDNA文库有什么不同？4．生物大分子相互作用研究技术的基本方法有哪些？安全阀基本知识如果压力容器(设备/管线等)压力超过设计压力…1.尽可能避免超压现象堵塞(BLOCKED)火灾(FIRE)热泄放(THERMALRELIEF)如何避免事故的发生?2.使用安全泄压设施爆破片安全阀如何避免事故的发生?01安全阀的作用就是过压保护!一切有过压可能的设施都需要安全阀的保护!这里的压力可以在200KG以上,也可以在1KG以下!设定压力(setpressure)安全阀起跳压力背压(backpressure)安全阀出口压力超压(overpressure)表示安全阀开启后至全开期间入口积聚的压力.几个压力概念弹簧式先导式重力板式先导+重力板典型应用电站锅炉典型应用长输管线典型应用罐区安全阀的主要类型02不同类型安全阀的优缺点结构简单,可靠性高适用范围广价格经济对介质不过分挑剔弹簧式安全阀的优点预漏--由于阀座密封力随介质压力的升高而降低,所以会有预漏现象--在未达到安全阀设定点前,就有少量介质泄出.100%SEATINGFORCE75502505075100%SETPRESSURE弹簧式安全阀的缺点过大的入口压力降会造成阀门的频跳,缩短阀门使用寿命.ChatterDiscGuideDiscHolderNozzle弹簧式安全阀的缺点弹簧式安全阀的缺点=10090807060500102030405010%OVERPRESSURE%BUILT-UPBACKPRESSURE%RATEDCAPACITY普通产品平衡背压能力差.在普通产品基础上加装波纹管,使其平衡背压的能力有所增强.能够使阀芯内件与高温/腐蚀性介质相隔离.平衡波纹管弹簧式安全阀的优点优异的阀座密封性能,阀座密封力随介质操作压力的升高而升高,可使系统在较高运行压力下高效能地工作.ResilientSeatP1P1P2先导式安全阀的优点平衡背压能力优秀有突开型/调节型两种动作特性可远传取压先导式安全阀的优点对介质比较挑剃,不适用于较脏/较粘稠的介质,此类介质会堵塞引压管及导阀内腔.成本较高.先导式安全阀的缺点重力板式产品的优点目前低压储罐呼吸阀/紧急泄放阀的主力产品.结构简单.价格经济.重力板式产品的缺点不可现场调节设定值.阀座密封性差,并有较严重的预漏.受背压影响大.需要很高的超压以达到全开.不适用于深冷/粘稠工况.几个常用规范ASMEsectionI-动力锅炉(FiredVessel)ASMEsectionVIII-非受火容器(UnfiredVessel)API2000-低压安全阀设计(LowpressurePRV)API520-火灾工况计算与选型(FireSizing)API526-阀门尺寸(ValveDimension)API527-阀座密封(SeatTightness)介质状态(气/液/气液双相).气态介质的分子量&Cp/Cv值.液态介质的比重/黏度.安全阀泄放量要求.设定压力.背压.泄放温度安全阀不以连接尺寸作为选型报价依据!如何提供高质量的询价?弹簧安全阀的结构弹簧安全阀起跳曲线弹簧安全阀结构弹簧安全阀结构导压管活塞密封活塞导向不平衡移动副(活塞)导管导阀弹性阀座P1P1P2先导式安全阀结构先导式安全阀的工作原理频跳安全阀的频跳是一种阀门高频反复开启关闭的现象。安全阀频跳时，一般来说密封面只打开其全启高度的几分只一或十几分之一，然后迅速回座并再次起跳。频跳时，阀瓣和喷嘴的密封面不断高频撞击会造成密封面的严重损伤。如果频跳现象进一步加剧还有可能造成阀体内部其他部分甚至系统的损伤。安全阀工作不正常的因素频跳后果1、导向平面由于反复高频磨擦造成表面划伤或局部材料疲劳实效。2、密封面由于高频碰撞造成损伤。3、由于高频振颤造成弹簧实效。4、由频跳所带来的阀门及管道振颤可能会破坏焊接材料和系统上其他设备。5、由于安全阀在频跳时无法达到需要的排放量，系统压力有可能继续升压并超过最大允许工作压力。安全阀工作不正常的因素A、系统压力在通过阀门与系统之间的连接管时压力下降超过3%。当阀门处于关闭状态时，阀门入口处的压力是相对稳定的。阀门入口压力与系统压力相同。当系统压力达到安全阀的起跳压力时，阀门迅速打开并开始泄压。但是由于阀门与系统之间的连接管设计不当，造成连接管内局部压力下降过快超过3%，是阀门入口处压力迅速下降到回座压力而导致阀门关闭。因此安全阀开启后没有达到完全排放，系统压力仍然很高，所以阀门会再次起跳并重复上述过程，既发生频跳。导致频跳的原因导致接管压降高于3%的原因1、阀门与系统间的连接管内径小于阀门入口管内径。2、存在严重的涡流现象。3、连接管过长而且没有作相应的补偿（使用内径较大的管道）。4、连接管过于复杂（拐弯过多甚至在该管上开口用作它途。在一般情况下安全阀入口处不允许安装其他阀门。）导致频跳的原因B、阀门的调节环位置设置不当。安全阀拥有喷嘴环和导向环。这两个环的位置直接影响安全阀的起跳和回座过程。如果喷嘴环的位置过低或导向环的位置过高，则阀门起跳后介质的作用力无法在阀瓣座和调节环所构成的空间内产生足够的托举力使阀门保持排放状态，从而导致阀门迅速回座。但是系统压力仍然保持较高水平，因此回座后阀门会很快再次起跳。导致频跳的原因C、安全阀的额定排量远远大于所需排量。

由于所选的安全阀的喉径面积远远大于所需，安全阀排放时过大的排量导致压力容器内局部压力下降过快，而系统本身的超压状态没有得到缓解，使安全阀不得不再次起跳频跳的原因阀门拒跳：当系统压力达到安全阀的起跳压力时，阀门不起跳的现象。安全阀工作不正常的因素1、阀门整定压力过高。2、阀门内落入大量杂质从而使阀办座和导套间卡死或摩擦力过大。3、弹簧之间夹入杂物使弹簧无法被正常压缩。4、阀门安装不当，使阀门垂直度超过极限范围（正负两度）从而使阀杆组件在起跳过程中受阻。5、排气管道没有被可靠支撑或由于管道受热膨胀移位从而对阀体产生扭转力，导致阀体内机构发生偏心而卡死。安全阀拒跳的原因阀门不回座或回座比过大：安全阀正常起跳后长时间无法回座，阀门保持排放状态的现象。安全阀工作不正常的因素1、阀门上下调整环的位置设置不当。2、排气管道设计不当造成排气不畅，由于排气管道过小、拐弯过多或被堵塞，使排放的蒸汽无法迅速排出而在排气管和阀体内积累，这时背压会作用在阀门内部机构上并产生抑制阀门关闭的趋势。3、阀门内落入大量杂质从而使阀瓣座和导套之间卡死后摩擦力过大。安全阀不回座或回座比过大的因素：4、弹簧之间夹入杂物从而使弹簧被正常压缩后无法恢复。5、由于对阀门排放时的排放反力计算不足，从而在排放时阀体受力扭曲损坏内部零件导致卡死。6、阀杆螺母（位于阀杆顶端）的定位销脱落。在阀门排放时由于振动使该螺母下滑使阀杆组件回落受阻。安全阀不回座或回座比过大的因素：7、由于弹簧压紧螺栓的锁紧螺母松脱，在阀门排放时由于振动时弹簧压紧螺栓松动上滑导致阀门的设定起跳值不断减小。

8、阀门安装不当，使阀门垂直度超过极限范围（正负两度）从而使阀杆组件在回落过程中受阻。

9、阀门的密封面中有杂质，造成阀门无法正常关闭。

10、锁紧螺母没有锁紧，由于管道震动下环向上运动，上平面高于密封面，阀门回座时无法密封安全阀不回座或回座比过大的因素：谢谢观看癌基因与抑癌基因oncogene&tumorsuppressorgene24135基因突变概述.癌基因和抗癌基因的概念.癌基因的分类.癌基因产物的作用.癌基因激活的机理主要内容疾病：

——是人体某一层面或各层面形态和功能（包括其物质基础——代谢）的异常，归根结底是某些特定蛋白质结构或功能的变异，而这些蛋白质又是细胞核中相应基因借助细胞受体和细胞中信号转导分子接收信号后作出应答（表达）的产物。TranscriptionTranslationReplicationDNARNAProtein中心法规Whatisgene?基因：

—是遗传信息的载体

—是一段特定的DNA序列（片段）

—是编码RNA或蛋白质的一段DNA片段

—是由编码序列和调控序列组成的一段DNA片段基因主宰生物体的命运：微效基因的变异——生物体对生存环境的敏感度变化关键关键基因的变异——生物体疾病——死亡所以才有：“人类所有疾病均可视为基因病”之说注：如果外伤如烧伤、骨折等也算疾病的话，外伤应该无法归入基因病的行列。Genopathy问：两个不相干的人，如果他们患得同一疾病，致病基因是否相同？再问：同卵双生的孪生兄弟，他们患病的机会是否一样，命运是否相同？┯┯┯┯

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┷┷┷┷增添缺失替换DNA分子(复制)中发生碱基对的______、______

和

，而引起的

的改变。替换增添缺失基因结构基因变异的概念：英语句子中的一个字母的改变，可能导致句子的意思发生怎样的变化？可能导致句子的意思不变、变化不大或完全改变THECATSATONTHEMATTHECATSITONTHEMATTHEHATSATONTHEMATTHECATONTHEMAT同理：替换、增添、缺失碱基对，可能会使性状不变、变化不大或完全改变。基因的结构改变,一定会引起性状的改变??原句：1.基因多态性与致病突变基因变异与疾病的关系2.单基因病、多基因病3.疾病易感基因

基因多态性polymorphism是指DNA序列在群体中的变异性（差异性）在人群中的发生概率>1%（SNP&CNP)<1%的变异概率叫做突变基因多态性特定的基因多态性与疾病相关时，可用致病突变加以描述SNP:散在单个碱基的不同，单个碱基的缺失、插入和置换。

CNP:DNA片段拷贝数变异，包括缺失、插入和重复等。同义突变、错义突变、无义突变、移码突变

致病突变生殖细胞基因突变将突变的遗传信息传给下一代(代代相传),即遗传性疾病。体细胞基因突变局部形成突变细胞群（肿瘤）。受精卵分裂基因突变的原因物理因素化学因素生物因素基因突变的原因（诱发因素）紫外线、辐射等碱基类似物5BU/叠氮胸苷等病毒和某些细菌等自发突变DNA复制过程中碱基配对出现误差。UV使相邻的胸腺嘧啶产生胸腺嘧啶二聚体,DNA复制时二聚体对应链空缺，碱基随机添补发生突变。胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶胸腺嘧啶紫外线诱变物理诱变(physicalinduction)

5溴尿嘧啶(5BU)与T类似，多为酮式构型。间期细胞用酮式5BU处理，5BU能插入DNA取代T与A配对；插入DNA后异构成烯醇式5BU与G配对。两次DNA复制后,使A/T转换成G/C，发生碱基转换,产生基因突变。化学诱变(chemicalinduction)碱基类似物(baseanalogues)诱变AT5-BUA5-BUAAT5-BU5-BU(烯醇式)

(酮式)GGC1.生物变异的根本来源，为生物进化提供了最初的原始材料,能使生物的性状出现差别，以适应不同的外界环境，是生物进化的重要因素之一。2.致病突变是导致人类遗传病的病变基础。基因突变的意义概述：肿瘤细胞恶性增殖特性（一）肿瘤细胞失去了生长调节的反馈抑制正常细胞受损,一旦恢复原状，细胞就会停止增殖，但是肿瘤细胞不受这一反馈机制抑制。（二）肿瘤细胞失去了细胞分裂的接触抑制。正常细胞体外培养，相邻细胞相接触，长在一起，细胞就会停止增殖，而肿瘤细胞生长满培养皿后，细胞可以重叠起生长。（三）肿瘤细胞表现出比正常细胞更低的营养要求。（四）肿瘤细胞生长有一种自分泌作用，自己分泌生长需要的生长因子和调控信号,促进自身的恶性增殖。Whatisoncogene?癌基因——是基因组内正常存在的基因，其编码产物通常作为正调控信号，促进细胞的增殖和生长。癌基因的突变或表达异常是细胞恶性转化（癌变）的重要原因。——凡是能编码生长因子、生长因子受体、细胞内信号转导分子以及与生长有关的转录调节因子等的基因。如何发现癌基因的呢?11910年，洛克菲勒研究院一个年轻的研究员Rous发现，鸡肉瘤细胞裂解物在通过除菌滤器以后，注射到正常鸡体内，可以引起肉瘤，首次提出鸡肉瘤可能是由病毒引起的。0.2m孔径细菌过不去但病毒可以通过从病毒癌基因到细胞原癌基因的研究历程：Roussarcomavirus,RSVthefirstcancer-causingretrovirus1958年，Stewart和Eddy分离出一种病毒，注射到小鼠体内可以引起肝脏、肾脏、乳腺、胸腺、肾上腺等多种组织器官的肿瘤，因而把这种病毒称为多瘤病毒。50年代末、60年代初，癌病毒研究成了一个极具想像力的研究领域，主流科学家开始进入癌病毒研究领域polyomavirus这期间，Temin发现RSV有不同亚型，且引起细胞恶变程度不同，推测RNA病毒将其遗传信息传递给了正常细胞的DNA。这与Crick提出的中心法则是相违背的让事实屈从于理论还是坚持基于实验的结果？VSTemin发现逆转录酶，1975年获诺贝尔奖TeminCrickTemin的实验设计：实验设计简单而巧妙：将合成DNA所需的“原料”，即A、T、C、G四种脱氧核苷酸，与破坏了外壳的RSV一起在体外40℃的条件下温育一段时间结果在试管里获得了一种新合成的大分子，它不能被RNA酶破坏，但却可以被DNA酶所分解，证明这种新合成的大分子是DNA用RNA酶预先破坏RSV的RNA，再重复上述的试验，则不能获得这种大分子，说明这个DNA大分子是以RSV的RNA为模板合成的1969年，一个日本学者里子水谷来到Temin的实验室，这是一个非常擅长实验的年轻科学家。按Temin的设想，他们开始寻找RSV中存在“逆转录酶”的证据DNA

RNA

ProteinTranscriptionTranslationReplicationReplicationRe-Transcription修正中心法规据说，1975年Temin因发现逆转录酶而获诺贝尔奖时，Bishop懊恼不已，因为早在1969年他就认为Temin的RNADNA的“前病毒理论”有可能是正确的，并且也进行了一些实验，但不久由于资深同事的规劝而放弃了这方面的努力。但Bishop马上意识到：逆转录酶的发现为逆转录病毒致癌的研究提供了一条新途径。一个RSV，三个诺贝尔奖！！！1989年，UCSF的Bishop和Varmus根据逆转录病毒的复制机制发现了细胞癌基因，并获诺贝尔奖。Cellularoncogene启示：Perutz说:“科学创造如同艺术创造一样，都不可能通过精心组织而产生”Bishop说:“许多人引以为豪的是一天工作16小时，工作安排要以分秒计……可是工作狂是思考的大敌，而思考则是科学发现的关键”Perutzsharedthe1962NobelPrizeforChemistrywithJohnKendrew,fortheirstudiesofthestructuresofhemoglobinandglobularproteins科学的本质和艺术一样，都需要直觉和想像力请给自己一些思考的时间吧！癌基因的分类目前对癌基因尚无统一分类的方法，一般有下面3种分类方法：一、按结构特点分（6）类（一）src癌基因家族（二）ras癌基因家族（三）sis癌基因家族（四）myc癌基因家族（五）myb癌基因家族（六）其它：如fos，erb－A等。三、按细胞增殖调控蛋白特性分成（4）类（一）生长因子（二）受体类（三）细胞内信号转换器（四）细胞核因子二、按产物功能分（8）类（一）生长因子类（二）酪氨酸蛋白激酶（三）膜相关G蛋白（四）受体，无蛋白激酶活性（五）胞质丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（六）胞质调控因子（七）核反式调控因子（八）其它:db1、bcl－2癌基因产物参与信号转导

胞外信号作用于膜表面受体→胞内信使物质的生成便意味着胞外信号跨膜传递的完成。胞内信使至少有：cAMP（环磷酸腺苷）IP3（三磷酸肌醇）PG（前列腺素）cGMP（环磷酸鸟苷）DG（二酰基甘油）Ca2＋（钙离子）CAM（钙调素）主要机制是通过蛋白激酶活化引起底物蛋白一连串磷酸化的生物信号反应过程,跨膜机制涉及到：（一）质膜上cAMP信使系统（二）质膜上肌醇脂质系统这两个系统都是由受体鸟苷酸调节蛋白（GTP-regulatoryprotein，G蛋白）和效应酶（腺苷酸环化酶磷脂酶等）组成，有相似的信号转导过程：即受体活化后引起GTP与不同G蛋白结合活化和抑制效应酶从而影响胞内信使产生而发生不同的调控效应。（三）受体操纵的离子通道系统（四）受体酪氨酸蛋白激酶的转导

（一）获得性基因病

(acquiredgeneticdisease)例如：病毒感染激活原癌基因癌基因活化的机制

（二）染色体易位和重排使无活性的原癌基因转位至强启动子或增强子附近而被活化。与基因脆性位点相关。（三）基因扩增（四）点突变三、癌基因的产物与功能（一）癌基因产物作用的一般特点1.目前发现c-onc均为结构基因.2.癌基因产物可分布在膜质核也可分泌至胞外.（二）癌基因产物分类1.细胞外生长因子：TGF-b2.跨膜生长因子受体:MAPK3.细胞内信号转导分子:Gprotein/Ras4.核内转录因子

（三）癌基因产物的协同作用实验证明，用ras或myc分别转染细胞，可使细胞长期增殖，但不能转化成癌细胞，在裸鼠体内也不能形成肿瘤。但用ras+myc同时转染细胞，则使细胞转化成癌细胞。说明：致癌至少需要2种或以上的onc协同作用，2种onc在2条通路上发挥作用，由于细胞增殖调控是多因子，多阶段影响的结果。而影响增殖分化的onc达几十种之多，所以大多数人认为：癌发生是多阶段多步骤的。Whatistumorsuppressorgene?肿瘤抑制基因（抗癌基因、抑癌基因）——是调节细胞正常生长和增殖的基因。当这些基因不能表达，或其产物失去活性时，细胞就会异常生长和增殖，最终导致细胞癌变。反之，若导入或激活它则可抑制细胞的恶性表型。——癌基因与抑癌基因相互制约，维持细胞增殖正负调节信号的相对稳定。影响1岁的儿童“二次打击”学说两个等位基因同时突变视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma）RB基因变异(13号染色体)

(1)脱磷酸化Rb蛋白（活性）与转录因子E2F结合，抑制基因的转录活性(2)磷酸化Rb蛋白（失活）与E2F解离，释放E2F(3)E2F启动基因转录(4)细胞进入增生阶段(G1S)因此，Rb蛋白在控制细胞生长方面发挥重要作用一旦Rb基因突变可使细胞进入过度增生状态RB基因的功能等位基因(allele)例如：花颜色基因位于一对同源染色体的同一位置上、控制相对性状的两个的基因叫等位基因(allele)一对相同的等位基因称纯合等位基因

一对不同的等位基因称杂合等位基因

显性基因隐性基因完全显性不完全显性共显性问：女性的两条X染色体基因应如何表达？拓展知识：X染色体基因中，有65%完全处于“休眠”状态，20%仅在部分女性身上“休眠”，15%则完全逃离“休眠”状态一旦其中一条X染色体被损坏，还可以由另一条X染色体来纠正男性却只有一条X染色体，一旦它遭到破坏，男性就会患上血友病、色盲以及肌肉萎缩症等各种遗传病以前人们一直认为，在女性的两条X染色体中，有一条染色体是完全不起作用或是处于“休眠”状态的在Y染色体中，目前仍在“工作”的基因只剩下不到100个X染色体中“工作”的基因>1000个有一个这样的故事：20年前一次意外事故，三个工人遭受钴60（Co60)放射性核素的照射结果：一名工人不久死亡一名工人几年后死于白血病最后一名工人20年后患糖尿病就诊你知道医生在为病人检查时发现了什么吗？锁骨骨折肋骨串珠样X光片发现广泛性骨质缺损骨髓检查——浆细胞比例为30%左右（正常为0.6-1.3%）(多发性骨髓瘤）因此，多基因病涉及遗传因素和环境因素物理因素化学因素生物因素自发因素2.多基因病(polygenicdisease)：性状或疾病的遗传方式取决于两个以上微效基因的累加作用，同时还受环境因素的影响，因此这类性状也称为复杂性状或复杂疾病（complexdisease）也叫：“复杂性状疾病”近视(myopia)高血压(hypertension)糖尿病(diabetes)精神分裂症(schizophrenia)哮喘(asthma)肿瘤或癌

(tumororcancer)多基因病的遗传要点数量性状的遗传基础是两对以上基因。这些基因之间没有显,隐性的区别,而是共显性。每个基因对表型的影响很小,称为微效基因。微效基因具有累加效应,即一个基因对表型作用很小,但若干个基因共同作用,可对表型产生明显影响。不仅遗传因素起作用,环境因素具有明显作用。例如：结肠癌（Coloncancer)相关基因：NGX6，SOX7，ITGB1，HSPA9B，MAPK8，PAG，

RANGAP1，SRC和CDC2等。相关信号通路：ras/MEK/ERK，JNK，Rb/E2F，PI3K/AKT及受体相互作用相关通路，免疫反应相关通路以及细胞黏附相关通路等。①早期原发癌生长②肿瘤血管形成③肿瘤细胞脱落并侵入基质④进入脉管系统⑤癌栓形成⑥继发组织器官定位生长⑦转移癌继续扩散例如：糖尿病(diabetes)依赖胰岛素型糖尿病在位于第6号染色体上可能包含至少一个对I型糖尿病敏感的基因在人类基因组中，大约10个位点现在被发现似乎对I型糖尿病敏感其中：1)11号染色体位点IDDM2上的基因

2)葡萄糖激酶基因高血压(hypertension)目前最受关注的是ATP2B1基因编码一种膜蛋白，具有钙泵特性能将高浓度细胞内钙泵出细胞外。精神神经性疾病精神分裂症基因表达改变/诱导增强家族史家暴基因本质：基因组变异惊吓—？—基因突变——精神病多基因病的遗传：易患性(liability)易感性(susceptibility)发病阈值(threshold)易患性(liability)——在多基因病发生中，遗传因素和环境因素共同作用决定一个个体患某种遗传病的可能性。possibility遗传因素(hereditaryfactors)环境因素(environmentalfactor)易感性(susceptibility)——特指由遗传因素决定的患病风险，仅代表个体所含有的遗传因素，易感性完全由基因决定。——在一定的环境条件下，易感性高低可代表易患性高低。riskwithdisease发病阈值(threshold)——当一个个体易患性高到一定限度就可能发病——这种由易患性所导致的多