细胞因子（免疫学检验课件）

细胞因子免疫系统:产生免疫功能的物质基础免疫系统免疫器官免疫细胞免疫分子免疫系统的组成细胞因子

细胞因子（cytokine，CK）机体的免疫细胞和非免疫细胞能合成和分泌小分子的多肽类因子，它们能调节多种细胞生理功能，这些因子统称为细胞因子。一、理化特性：多为小分子(8~30KD)蛋白或糖蛋白,多以单体形式存在，少数为二聚体(IL-10、IL-12等)或三聚体(TNF)。二、分泌特点:多为旁分泌、自分泌，少数为内分泌。第一节细胞因子的特性

（二）多向性：一种细胞可产生多种细胞因子，几种不同类型细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子。三、产生特性:

（一）多源性:活化的各种免疫细胞、非免疫细胞及某些肿瘤细胞均可产生细胞因子。四、作用特点:

（一）高效性：只需极少量（pmol/L水平）细胞因子就能产生明显的生物学效应;

（二）多效性：一种细胞因子可对多种细胞发挥作用，产生多种生物学效应;

（四）拮抗性：一种细胞因子可以抑制另一种细胞因子的某种生物学作用。如：IL-4IFN-γ

（三）重叠性：几种不同细胞因子也可对同一种细胞发挥作用，产生相同或相似的生物学效应;

（五）协同性：一种细胞因子可以增强另一种细胞因子的功能；（六）两面性：通常情况下，发货抗感染、抗病毒、促进造血和免疫调节等功能，但在一些异常情况下又参与炎症反应、诱导肿瘤等疾病的发生。

（七）非特异性：细胞因子以非特异性方式发挥作用,不受MHC限制，细胞因子必须与相应受体结合才能发挥效应;

（八）网络性：细胞因子之间通过合成分泌的作用相互调节、生物学效应的相互影响，从而形成复杂而有序的因子网络，达到机体稳态平衡。一、根据细胞因子的来源分类由单核细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine，MK)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子(lymphokine，LK)。二、依据细胞因子的生物学功能分类可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化因子等六大类。第二节细胞因子的分类（一）白细胞介素（interleukin,IL）

白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。（二）肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)：TNF-α、β（分别由单核-巨噬细胞、T细胞产生）

生物学效应：1.抗肿瘤作用

2.抗病毒作用

3.免疫调节作用

4.促炎症因子

5.致热作用

6.恶病质(三)干扰素（interferon,IFN）由病毒或干扰素诱生剂刺激机体细胞产生的一种具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功能的小分子多肽。

I型IFN-α

IFN-β

抗病毒、抗肿瘤

II型IFN-r

免疫调节(四)集落刺激因子（colony-stimulatingfactor，CSF）：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、EPO、TPO等。(五)趋化因子（chemokine）：促进淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞等到达炎症部位并激活。(六)生长因子（growthfactor，GF）：TGF-β、EGF、NGF、VEGF、FGF等。

各类细胞因子在造血过程中的作用二、介导炎症反应一、参与和调节免疫应答三、抗感染和抗肿瘤作用四、刺激造血功能第三节细胞因子的主要生物学作用五、诱导细胞凋亡细胞因子对Th1和Th2细胞分化的调节作用免疫调节作用1.细胞因子及受体缺陷

2.细胞因子过高表达

3.可溶性受体水平升高第四节细胞因子的医学意义一、细胞因子与疾病的发生（一）引起发热及内毒素休克(IL-1、IL-6、TNF-α)（二）与某些肿瘤的形成有关(IL-10)（三）与某些免疫相关性疾病的发生有关二、细胞因子与疾病的诊断

许多疾病都可造成细胞因子的改变，但一般缺少特异性。如类风湿性关节炎、感染性休克、免疫复合物肾病等疾病中IL-1均可出现增多。A.细胞因子补充疗法B.细胞因子阻断疗法

三、细胞因子与疾病的治疗1.治疗方式例：IL-10：类风湿性关节炎；EPO:血细胞减少症IL-1、IFN：多种肿瘤。

第四节细胞因子相关检验技术（一）细胞增殖测定法以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激依赖性细胞株的增殖，来评估细胞因子的活性水平。检测细胞增殖的常用方法有3H-TdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。一、细胞因子的生物学检测法待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）按不同稀释度加入37ºC，16h~20h加入3H-TdR（1Ci~5Ci）37ºC，4h~6h收集细胞测定白细胞介素-2的测定示意图

通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定

优点缺点方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染放射性核素掺入法（二）细胞毒活性测定对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用一系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测细胞因子活性的定量测定。本法常用于TNF等的测定（三）抗病毒活性测定法

本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染从而抑制细胞病变。（四）趋化活性测定法

多种细胞因子具有趋化活性，能分别诱导中性粒细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞等定向迁移。

利用分子生物学技术，制备出细胞因子的基因探针，通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子基因的表达，这是一种高度敏感和高度特异的检测技术，目前在实验室研究中使用较广，其缺点是操作较为烦琐，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。二、细胞因子的分子生物学检测法（一）Northern印迹杂交法（二）斑点杂交法（dotbloting）（三）PCR与逆转录PCR（四）原位杂交和原位PCR

利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量分析细胞因子。（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）

是定量分析中最常用方法。但不能判断细胞因子的生物学活性。三、细胞因子的免疫学检测法ELISA方法ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。ELISA特异、简便易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法优点缺点(二)酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)

在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关基本原理ELISPOT（三）流式细胞分析法

流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。1．分离和培养待检细胞2．细胞固定3．封闭非特异性结合位点4．染色与分析基本步骤细胞内细胞因子检测技术激活膜抗原标记细胞内细胞因子标记使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：

Th1细胞IFN-γTh2细胞IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术直接或间接荧光抗体染色无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态免疫学测定方法学评价优点：特异性高操作简