实验三血清醋酸纤维薄膜电泳

实验三血清醋酸纤维薄膜电泳第1页，课件共32页，创作于2023年2月实验目的：掌握电泳的基本原理，加深对蛋白质两性解离性质的理解。掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本操作。第2页，课件共32页，创作于2023年2月实验原理

第3页，课件共32页，创作于2023年2月电泳技术（Electrophoresis）

电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳.正极负极带负电粒子带正电粒子第4页，课件共32页，创作于2023年2月背景：电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。

第5页，课件共32页，创作于2023年2月为了克服溶液对电泳离子的影响，一般在电泳体系中加入不流动的固体支持物。（一）按支持物的物理性状不同，可分为：1．滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、聚氯乙烯纤维薄膜、醋酸纤维)电泳2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3．凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。电泳的分类

第6页，课件共32页，创作于2023年2月（二）按支持物的装置形式不同，可分为：1．平板式电泳：支持物水平放置；2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳

第7页，课件共32页，创作于2023年2月(三)按pH的连续性不同，区带电泳可分为：1．连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2．非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。

第8页，课件共32页，创作于2023年2月电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即

V—粒子运动的速度X—电场强度Q—粒子所带电荷r—粒子的半径η—介质的粘度影响电泳速度的主要因素

第9页，课件共32页，创作于2023年2月

1.样品本身:

分子带电量：Q越多，u越大；分子大小:分子小，r越小，u越大；

分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦 越小，u越大。形状越规则，u越大，反之则越小。球形分子>纤维状分子第10页，课件共32页，创作于2023年2月2.缓冲溶液：A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大B.离子强度(I)：离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。第11页，课件共32页，创作于2023年2月3.电场强度(X):

电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。注意：电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。第12页，课件共32页，创作于2023年2月电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。4．电渗现象第13页，课件共32页，创作于2023年2月醋酸纤维薄膜电泳第14页，课件共32页，创作于2023年2月

醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。

醋酸纤维素薄膜电泳有以下优点：微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象

第15页，课件共32页，创作于2023年2月实验原理以蛋白质为例：pH>pIpH=pIpH<pIH＋H＋OH－OH－蛋白质兼性离子蛋白质阳离子蛋白质阴离子（等电点）实验原理以蛋白质为例：实验原理第16页，课件共32页，创作于2023年2月人血清中几种主要蛋白组分血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％清蛋白4.64

69,00057～72α1－球蛋白5.06

200,0002～5α2－球蛋白5.06300,000

4～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

缓冲液pH=8.6

pH>pI血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。第17页，课件共32页，创作于2023年2月

经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带第18页，课件共32页，创作于2023年2月染色和定量膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。第19页，课件共32页，创作于2023年2月实验步骤：1．准备与点样：取一条2.5×8cm的膜条充分浸透在巴比妥缓冲液中取出膜条滤纸吸去多余的缓冲液无光面距一端1.5cm处作点样线点样器下端粘上薄层血清垂直点样第20页，课件共32页，创作于2023年2月（注意：在薄膜负极端写好学号或者做好标记)第21页，课件共32页，创作于2023年2月2．电泳放置膜条点样端置于阴极点样面向下膜条贴紧滤纸，拉直膜条平衡10分钟通电电压：160v时间：50min关闭电源第22页，课件共32页，创作于2023年2月第23页，课件共32页，创作于2023年2月3．染色、脱色通电完毕取出膜条浸于染色液（氨基黑10B）中3min取出膜条依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5min直至漂净滤纸吸干薄膜第24页，课件共32页，创作于2023年2月第25页，课件共32页，创作于2023年2月４.定量(两人的膜条共用)取试管6支，编号1~6试管编号

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH

6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白条带清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白无蛋白区充分振荡、脱净染料比色、定量15min第26页，课件共32页，创作于2023年2月实验结果：原始数据：各样品吸光度值清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白A仪器型号：吸收波长：650nm第27页，课件共32页，创作于2023年2月光密度总和T＝2A＋α1＋α2＋β＋γ1．计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。

清蛋白％＝（2A/∑T）×100％ α1球蛋白％＝（α1

/∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2

/∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/∑T）×100％2．计算出清蛋白与球蛋白之比值（2A/G）

G=α1＋α2＋β＋γ第28页，课件共32页，创作于2023年2月血清蛋白电泳结果的临床意义：可能相关疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*肾病综合症↓↑*↑*肾炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝坏死↓*↑↑↑↑传染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎症/感染后期↑*低球蛋白血症↓*临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系：正常人A/G＝1.5～2.5第29页，课件共32页，创作于2023年2月注意事项：1、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。第30页，课件共32页，创作于2023年2月4