色谱分析导论课件

提纲方法原理色谱别离理论色谱定性定量分析提纲方法原理色谱别离理论色谱定性定量分析抗坏血酸的生物活性

L(100%)D(无)L异(无)D异(5%)1方法原理LD异1.1混合组分的别离AE03-B萃取器1方法原理多级串联离心萃取机〔实现多级串联逆流洗涤或萃取〕1方法原理1.2色谱别离1903年俄国植物学家茨维特别离植物色素1方法原理混合色素CaCO3石油醚绿色层(叶绿素A）黄色层（叶黄素）黄色层(胡萝卜素)洗出液1.2.1色谱别离原理P111

固定相:将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相〔固体或液体〕；流动相:自上而下运动的一相〔气体或液体〕；色谱柱:装有固定相的管子〔玻璃管或不锈钢管〕。1方法原理当流动相中样品混合物经过固定相时，会与固定相发生作用;

由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异;

在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，

各组分按先后不同的次序从固定相中流出。1方法原理1.2.2色谱法的分类

气相色谱(GC):气体为流动相的色谱分析方法气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)液相色谱(LC):液体为流动相的色谱分析方法液固色谱〔LSC〕液液色谱(LLC)超临界流体色谱(SFC):流动相的色谱分析方法1方法原理1方法原理流动相气体液体方法名称气相色谱液相色谱固定相固体吸附剂液体固体吸附剂液体方法名称气-固色谱气-液色谱液-固色谱液-液色谱1.3色谱流出曲线及有关术语P1221.3.1基线

在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线，但实际中存在漂移。1方法原理

1.3.2色谱流出曲线1方法原理色谱峰峰高:色谱峰顶点与基线之间的垂直距离峰面积:组分的流出曲线与基线所包围的面积定量分析的主要依据

1方法原理标准偏差

对应0.607峰高的一半峰宽值半峰宽W1/2

对应0.5峰高的宽值

W1/2=2.354

峰底宽度WW=4

1方法原理

死时间tM/死体积VM

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。

1方法原理信号tM进样保存时间tR/保存体积VRP123试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间或流出的体积。1方法原理信号进样tR1.3.6调整保存时间tR//调整保存体积VR/某组分的保存时间扣除死时间后，称为该组分的调整保存时间或流出的体积。tR´=tRtMVR´=VRVM1方法原理信号进样tR/分配系数KP124分配色谱的别离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复屡次的分配过程，而吸附色谱的别离是基于反复屡次的吸附-脱附过程。1方法原理1.3.8分配比kP124

分配比又称容量因子，指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。1方法原理分配系数K与分配比k的关系

K=k.

相比率(β)反映各种色谱柱柱型特点的一个重要参数。填充柱，β值一般为6~35

毛细管柱，β值为60~6001方法原理色谱流出曲线的用途从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的保存值，可以进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；色谱峰的保存值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；色谱峰两峰间的距离，是评价固定相〔或流动相〕选择是否适宜的依据。1方法原理提纲方法原理色谱别离理论色谱定性定量分析提纲方法原理色谱别离理论色谱定性定量分析2.1塔板理论P124

把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。

2色谱别离理论在每一块塔板上，溶质在两相间很快到达分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数：n=L/Hn:理论塔板数与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。2色谱别离理论塔板理论指出：当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到根本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103~106，因而流出曲线可趋近于正态分布曲线。(2)当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复屡次的分配平衡后，仍可获得良好的别离。2色谱别离理论n与半峰宽及峰底宽的关系式：n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2在tR一定时，如果色谱峰很窄，那么说明n越大，H越小，柱效能越高。实际上反映色谱柱的别离效能:n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2H有效=L/n有效2色谱别离理论例题1：某组分峰的峰底宽为40s，保存时间为400s，死时间为20s,计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tR/W)2=16(400/40)2=1600(块)n有效=16(tR/W)2=16(380/40)2=1444(块)2色谱别离理论2.2速率理论1956年荷兰学者vanDeemter〔范第姆特〕等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论—速率理论。它吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，在动力学根底上较好地解释了影响板高的各种因素。理论模型对气相、液相色谱都适用。2色谱别离理论速率理论的数学简化式P125

H=A+B/u+Cu

A:涡流扩散项〔多路效应项〕B/u:分子扩散项〔纵向扩散项〕Cu:传质阻力项2色谱别离理论①涡流扩散项AP125当组分在填充色谱柱中随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动。填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。2色谱别离理论气相色谱中涡流扩散引起的峰形扩展2色谱别离理论液相色谱中涡流扩散引起的峰形扩展2色谱别离理论色谱峰变宽的程度：A=2λdPA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规那么因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散,A=0。2色谱别离理论②分子扩散项B/u〔纵向扩散项〕P126由浓度梯度造成的分子扩散。组分从柱入口参加，其浓度分布的构型呈“塞子〞状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子〞必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数B=2γDgγ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。2色谱别离理论纵向分子扩散使峰展宽〔a〕柱内谱带构型〔b〕相应的响应信号2色谱别离理论（a）（b）液相色谱中分子扩散引起的峰形扩展2色谱别离理论③传质阻力项CuP126

气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，传质过程不完全相同。气液色谱传质阻力系数C：气相传质阻力系数Cg液相传质阻力系数CL

C=Cg+CL

传质阻力项Cu＝Cgu+CLu2色谱别离理论2.2.2液相色谱速率方程

H=HE+HL+HS+HMM

=A+B/u+Cu

HE=A

：涡流扩散项

HL＝B/u：分子扩散项

Cu

＝HS+HMM

：传质阻力项

HS

：固定项的传质阻力项

HMM

：流动项的传质阻力项

2色谱别离理论在液液分配色谱中，传质阻力系数〔C〕包含固定相传质阻力系数〔Cs〕和流动相传质阻力系数〔Cm〕：C=Cs＋Cm2色谱别离理论①固定相传质阻力系数〔Cs〕2色谱别离理论液体流动相进样后起峰形溶解在固定液表面溶质分子达到峰的前沿样品移出色谱柱时的峰形溶解在固定液内部溶质分子达到峰的后尾固定液

②流动相传质阻力系数Cm

流动的流动相中的传质阻力：mmdp2/Dm

滞留的流动相中的传质阻力：smdp2/Dm

Cm=mmdp2/Dm+smdp2/Dm2色谱别离理论移动流动相的传质阻力2色谱别离理论进样后的峰形移动流动相在固体颗粒间构成的层流样品移出色谱柱时峰形固定相基体固定相基体滞留的流动相中的传质阻力2色谱别离理论固体相基体进样后的峰形

滞留流动相固定液膜样品移出色谱柱时峰形2.3别离效能指标P127

色谱柱的总别离效能指标—别离度(R)别离度是一个综合性指标。别离度是既能反映柱效率,又能反映选择性的指标，称总别离效能指标。

R<1，两峰有局部重叠；R=1，别离程度可达98%；R=1.5，别离程度可达99.7%,作为相邻两组分已完全别离的标志。2色谱别离理论2.3.2影响别离度的主要因素P128别离度与柱效的关系别离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。固定相确定，被别离物质对的别离度将取决于n：

(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

增加色谱柱的长度可以提高别离度，但延长分析时间。提高别离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高别离度。2色谱别离理论例题2：物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保存时间分别为16.40min和17.63min。不被保存组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min。试计算：〔1〕柱的别离度〔2〕柱的平均塔板数〔3〕到达完全别离所需的柱长度2色谱别离理论解:〔1〕柱的别离度R=2(tR2-tR1)/〔W1+W2〕R=2(17.63-16.4)/(1.11+1.21)=1.06〔2〕柱的平均塔板数n=16(tR/W)2n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=〔3493+3397)/2=34452色谱别离理论〔3〕到达完全别离，R≥1.5所需的柱长度(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2解1：(1.06/1.5)2=30.0/L2L2=60cm解2：n2=3445(1.5/1.06)2=6898L2=n×H=6898(30.0/3445)=60cm2色谱别离理论

2.2.2对板高的影响因素(1)流动相线速度对板高的影响P131LC和GC的H—u图相似对应某一流速都有一个板高的极小值;

极小值就是柱效最高点。

LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多。2色谱别离理论(2)分子扩散项和传质阻力项对板高的影响较低线速时，分子扩散项起主要作用较高线速时，传质阻力项起主要作用高线速度时，固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素，随着速度增高，板高值越来越大，柱效急剧下降；流动相传质阻力项对板高的奉献几乎是一个定值。2色谱别离理论(3)固定相粒度大小对板高的影响

粒度越细，板高越小，受线速度影响亦小，这是HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。2色谱别离理论提纲方法原理色谱别离理论色谱定性定量分析提纲方法原理色谱别离理论色谱定性定量分析3.1色谱的定性分析P133各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保存值，可作为一种定性指标。目前色谱定性方法都是基于保存值。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保存值，即保存值并非专属的。因此仅根据保存值对一个完全未知的样品定性是困难的。在了解样品的来源、性质、分析目的的根底上，对样品组成作初步的判断，结合以下的方法那么可确定色谱峰所代表的化合物。3色谱定性定量分析保存指数法又称为柯瓦〔Kováts〕指数，它表示物质在固定液上的保存行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。

具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。保存指数是把正构烷烃中某两个组分的调整保存值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保存指数为n100。被测物的保存指数值可用内插法计算。3色谱定性定量分析

3色谱定性定量分析保存指数的意义：与被测物质具有相同调整保存时间的假想的正构烷烃的碳数乘以100；保存指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关；其准确度和重现性都很好。只要柱温与固定相相同，就可用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。3色谱定性定量分析3.2色谱定量分析P1333.2.1定量依据当操作条件一致时，被测组分的质量(或浓度)与检测器给出的响应信号成正比。即：

mi=fi×Aimi=fi×hi

式中mi为被测组分i的质量；Ai为被测组分i的峰面积；

fi为被测组分i的校正因子。3色谱定性定量分析色谱定量分析的过程准确测量检测器的响应信号—峰面积或峰高；准确求得比例常数—校正因子；正确选择适宜的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。3色谱定性定量分析3.2.3峰面积的测量对称形峰面积的测量—峰高乘以半峰宽法

A=1.065hW1/2(2)不对称形峰面积的测量—峰高乘平均峰宽法不对称峰的测量采用峰高乘以半峰宽，误差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法。

A=h×(W0.15+W0.85)/23色谱定性定量分析3.2.4定量校正因子峰面积的大小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。因此，混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率。不能直接利用峰面积计算物质的含量。为了使峰面积能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，需要引入校正因子。3色谱定性定量分析绝对校正因子：fi=mi/Aifi值与组分i的质量绝对值成正比，所以称为绝对校正因子。在定量分析时要精确求出fi值是比较困难：精确测量绝对进样量困难；峰面积与色谱条件有关，要保持测定fi值时的色谱条件相同，既不可能又不方便；即便能够得到准确的fi值，也由于没有统一的标准而无法直接应用。3色谱定性定量分析(2)相对校正因子①相对校正因子的定义

fi=fi/fs

即某组分i的相对校正因子fi为组分i与标准物质s的绝对校正因子之比。

fi=(mi/Ai)/(ms/As)=(mi/ms).(As/Ai)3色谱定性定量分析②相对校正因子的测定方法相对校正因子值只与被测物和标准物以及检测器的类型有关，而与操作条件无关。因此，fi值可自文献中查出引用。文献中查不到所需的fi值，也可以自己测定。常用的标准物质苯：热导检测器〔TCD〕正庚烷：氢焰检测器〔FID〕测定相对校正因子最好是用色谱纯试剂。假设无纯品，也要确知该物质的百分含量。测定时首先准确称量标准物质和待测物，然后将它们混合均匀进样，分别测出其峰面积，再进行计算。3色谱定性定量分析定量分析方法P135

归一化法

把所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方法称为归一化法。其计算公式如下：

3色谱定性定量分析归一化法的优点是简单、准确，操作条件变化时对定量结果影响不大。在实际工作中仍有一些限制:

样品的所有组分必须全部流出，且出峰。某些不需要定量的组分也必须测出其峰面积及fi

值；测量低含量尤其是微量杂质时，误差较大。3色谱定性定量分析例题3：在一个苯系混合物液中，用气相色谱法分析，获得如下数据，计算各组分的含量。3色谱定性定量分析组分苯甲苯邻二甲苯对二甲苯间二甲苯fi0.7800.7940.8400.8120.801h/cm4.203.067.502.981.67W1/2/cm0.150.160.170.180.19解：P苯=1.065×

0.780×4.20×0.15=0.523A=1.065×0.780×4.20×0.15+1.065×0.794×

3.06×0.16+1.