高效液相色谱分析学时

高效液相色谱分析学时第1页，课件共69页，创作于2023年2月主要内容3-1HPLC的发展3-2HPLCE与经典液相色谱法和GC的差异3-3液相色谱法的原理和特点3-4高效液相色谱的分类和原理3-5液相色谱仪3-6液相色谱的固定相与流动相3-7影响分离的因素与操作条件的选择第2页，课件共69页，创作于2023年2月

3-1HPLC的发展

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

第3页，课件共69页，创作于2023年2月

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。第4页，课件共69页，创作于2023年2月

现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。现代液相色谱第5页，课件共69页，创作于2023年2月3-2HPLCE与经典液相色谱法和GC的差异第6页，课件共69页，创作于2023年2月

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法

高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1.

对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.第7页，课件共69页，创作于2023年2月经典液相色谱法高效液相色谱法（分析型）固定相一般规格特殊规格固定相粒度（μm）75~5003~20固定相粒度分布(RSD)20~30%<5%柱长（cm）10~10010~30柱内径（cm）2~50.1~0.5柱入口压强（kg/cm2）0.01~120~300柱效(每米理论塔片数)10~100104~105样品用量（g）1~1010-7~10-2分析所需时间（h）1~200.05~0.5装置非仪器化仪器化第8页，课件共69页，创作于2023年2月气相色谱法对挥发性样品是非常有效的分离方法．但是，对分子量超过300的组分及热分解产品都不适用．由于样品在工作温度下必须汽化这个特点限制了它的应用．为此，人们不得不通过柱前衍生法使样品能够汽化，这样大大加重了分析前处理的复杂性和数据的准确性．而高效液相色谱只需要样品能制成溶液，不需汽化，不受样品挥发性的限制．特别适用于高分子化合物，易热降解的物质及生物活性物质的分离，因此应用面比气相色谱要高得多．2．高效液相色谱法与气相色谱法第9页，课件共69页，创作于2023年2月气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）应用范围占有机物的20%占有机物的80%分离效果高更高选择性流动相是气体，只能选择固定相流动相是液体，流动相、固定相都可选择。选择性广。温度高温常温（分离效果好）灵敏度(g/ml)10-12

10-9

第10页，课件共69页，创作于2023年2月项目高效液相色谱法气相色谱法进样方式样品制成溶液样品需气化或裂解流动相溶液惰性气体分离原理吸附、分配、筛析、亲和等吸附和分配检测器UVD、PDAD、RID等TCD、FID、ECD等应用范围低、中、高沸点有机化合物离子型无机化合物热不稳定化合物生物活性分子低沸点有机化合物永久性气体第11页，课件共69页，创作于2023年2月

总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。第12页，课件共69页，创作于2023年2月3-3液相色谱法的原理和特点第13页，课件共69页，创作于2023年2月液相色谱分离原理原理：

被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。

液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂第14页，课件共69页，创作于2023年2月液相色谱分离原理根据分离机制不同，液相色谱可分为：

液固吸附色谱液液分配色谱化合键合色谱离子交换色谱分子排阻色谱等类型第15页，课件共69页，创作于2023年2月特点：高压——压力可达150～350x105Pa。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速——流速为0.1～10.0mL/min。高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第16页，课件共69页，创作于2023年2月3-4高效液相色谱的分类和原理第17页，课件共69页，创作于2023年2月1、液-固吸附色谱

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第18页，课件共69页，创作于2023年2月固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104

球形YQG3~4μm8×108

堆积硅珠YQG3~4μm8×108

理想

原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物第19页，课件共69页，创作于2023年2月流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂

例：正己烷或庚烷+氯仿---1．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑

溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间2．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱3．硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液第20页，课件共69页，创作于2023年2月2、液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。第21页，课件共69页，创作于2023年2月（1）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异（2）固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用

固定液——极性→正相

固定液——非极性→反相

（3）正相色谱——固定液极性>流动相极性（正相

）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分

反相色谱——固定液极性<流动相极性（反相

）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分第22页，课件共69页，创作于2023年2月利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面

分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）

特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱（4）化学键合固定相第23页，课件共69页，创作于2023年2月3、离子交换色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。第24页，课件共69页，创作于2023年2月离子交换色谱

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；

阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第25页，课件共69页，创作于2023年2月第26页，课件共69页，创作于2023年2月离子色谱图第27页，课件共69页，创作于2023年2月离子色谱的应用

阴离子分析:

双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),

流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。第28页，课件共69页，创作于2023年2月3-5液相色谱仪第29页，课件共69页，创作于2023年2月第30页，课件共69页，创作于2023年2月第31页，课件共69页，创作于2023年2月第32页，课件共69页，创作于2023年2月第33页，课件共69页，创作于2023年2月液相色谱法流程及主要部件流程第34页，课件共69页，创作于2023年2月第35页，课件共69页，创作于2023年2月优化流路减小死体积流路自上而下堆积配置手持控制器检测器

柱温箱自动进样器泵脱气机

溶剂柜第36页，课件共69页，创作于2023年2月各部分组成简介一、高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。二、进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。三、分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。四、检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。第37页，课件共69页，创作于2023年2月

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。

1、高压输液泵第38页，课件共69页，创作于2023年2月

对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种：（1）恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；（2）恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。第39页，课件共69页，创作于2023年2月第40页，课件共69页，创作于2023年2月2、洗脱方式

1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）第41页，课件共69页，创作于2023年2月梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第42页，课件共69页，创作于2023年2月梯度淋洗程序0～10分钟：流动相A（％）：30→35；流动相B（％）：70→65

10～21分钟：流动相A（％）：35→50；流动相B（％）：65→50

21～26分钟：流动相A（％）：50；流动相B（％）：50

第43页，课件共69页，创作于2023年2月3、进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：第44页，课件共69页，创作于2023年2月第45页，课件共69页，创作于2023年2月4、高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第46页，课件共69页，创作于2023年2月

（1）色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。（2）一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。

第47页，课件共69页，创作于2023年2月

（3）一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。（4）柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。第48页，课件共69页，创作于2023年2月5、液相色谱检测器（1）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

第49页，课件共69页，创作于2023年2月(2)荧光检测器

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；光电二极管阵列检测器示差折光检测器

第50页，课件共69页，创作于2023年2月3-6液相色谱的固定相与流动相第51页，课件共69页，创作于2023年2月固定相1.液-液分配及离子对分离固定相

（1）全多孔型担体（2）表面多孔型担体（3）化学键合固定相2.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型3.离子交换色谱分离固定相

（1）薄壳型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相4.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶

（2）半硬质凝胶（3）硬质凝胶

第52页，课件共69页，创作于2023年2月1.液-液分配及离子对分离固定相在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。液液色谱的固定相由载体和固定液组成。载体由硅胶、硅藻土等材料制成。而固定液有，—氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。流动相：当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。第53页，课件共69页，创作于2023年2月

（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；

（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；第54页，课件共69页，创作于2023年2月（3）化学键合固定相

化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N第55页，课件共69页，创作于2023年2月化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；

存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

第56页，课件共69页，创作于2023年2月

2.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

第57页，课件共69页，创作于2023年2月3.离子交换色谱分离固定相

结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）第58页，课件共69页，创作于2023年2月流动相

流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。第59页，课件共69页，创作于2023年2月流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长

要长。第60页，课件共69页，创作于2023年2月（3）高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳或产生“伪峰”。（4）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第61页，课件共69页，创作于2023年2月流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第62页，课件共69页，创作于2023年2月流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>