《IRNA的转录后加工》课件

第二节RNA的转录后加工RNA成熟转录后加工（post-transcriptionalprocessing）

1整理ppt一原核生物中RNA的加工：（一）原核生物rRNA前体加工：pppA6500nt2整理ppt（二）原核生物tRNA前体加工：

1.tRNA前体两侧切断(cutting)及修剪(trimming)：1）5’tRNA成熟酶——RNasePRNaseP蛋白：20kDaRNA（M1RNA）：ribozymeRNaseP是识别RNA特定空间结构而非一级结构的核酸内切酶2）tRNA3’-端：切割——RNaseF成熟——RNaseD3整理ppt2.tRNA3’-末端CCAOH结构的形成：

（1）自身含有-CCAOH结构，经过修剪后暴露。（2）由tRNA核苷酰转移酶催化形成-CCAOH：tRNA+2CTP+ATPtRNA-CCAOH+3PPi3.tRNA分子中核苷酸修饰和异构化：例如：假尿嘧啶（）的形成（U糖苷键移位，N1

C5）

4整理ppt切除tRNA前体两端多余的序列：

5’—端切除几到10个核苷酸。b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修饰：形成稀有碱基如DH2。RNAasePRNAasePRNAaseFRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC核酸内切酶的作用核苷酰转移酶的作用

核酸外切酶的作用

异构化酶的作用

5整理ppt（三）原核生物mRNA前体加工：细菌的mRNA大多数不需要加工，边转录边翻译。

少数如核糖体蛋白L10和L7/L12和RNA聚合酶的和’亚基组成多顺反子转录产物，需要经RNaseIII切割后分别翻译6整理ppt

细菌mRNA的特点：①多顺反子：一个mRNA可以翻译出不止一个蛋白产物②半衰期短：mRNA降解在转录开始后1min就开始了mRNA平均半衰期为2min（脊椎动物3hr)③5’端无帽子结构，3’端只有较短的polyA结构④起始密码上游7~12bp处有一个SD序列（Shine-Dalgarnosequence)，与核糖体小亚基16SrRNA3’端互补7整理ppt二真核生物RNA的一般加工：（一）真核生物rRNA前体加工：真核生物rRNA前体合成、加工及核糖体装配都在核仁中进行。受核仁小分子RNA（snoRNA）指导真核生物rRNA基因无内含子，有也不被转录。5SrRNA基因簇RNA聚合酶III转录加工5S真核生物rRNA基因成簇排列：

32S(2.1106）28S(1.7106）45S41S5.8S(5104）20S(0.9106）18S（0.65106）

由RNA聚合酶I转录8整理ppt（二）真核生物tRNA前体加工：真核生物tRNA基因也是成簇排列，由RNA聚合酶III转录。真核生物tRNA基因：约1300个果蝇tRNA基因：约850个大肠杆菌tRNA基因：约60个5’-tRNA成熟酶类似于原核生物RNaseP（但其中的RNA不是ribozyme），3’-端需要多种酶。真核生物tRNA自身不含有-CCAOH结构，全部由tRNA核苷酰转移酶催化合成。甲基化、假尿嘧啶化9整理ppttRNA的初级产物(4.8S，100Nt)成熟tRNA(4S，70-80Nt)加工内切酶外切酶连接酶10整理ppt（三）真核生物mRNA前体加工：真核生物基因是断裂基因（interruptedgene）1977年Roberts和Sharp提出，1993年Nobel医学/生理学奖真核生物mRNA为单顺反子，含有内含子。内含子（intron)：在RNA拼接时被切除的序列，不表达也称为间隔序列（interveningsequence,IVS)外显子（exon)：成熟RNA中出现的序列部分真核编码蛋白的mRNA内含子基因结构特征：GT-AG规律即：mRNA内含子的5’–端都是GU；而3’–端都是AG11整理ppt核内不均一RNA（heterogenousnuclearRNA，hnRNA)：

核内加工过程中mRNA前体形成的分子量大小不一的中间物。也称为D-RNA。

hnRNA半寿期多数很短，几分钟至几小时。而细胞质中的mRNA寿命较长，1~10hr12整理ppt2.真核生物mRNA加工的一般步骤：（1）5’帽子的形成（capping）:

5’帽子：真核生物mRNA5’–末端特征结构，是在mRNA5’–末端反向接上的一个甲基化的鸟苷酸。典型5’帽子结构：m7GpppNpN…（Cap0）m7GpppNmpN…（CapI）m7GpppNmpNmpN…（CapII）m7G：G碱基7位甲基化；Nm：核糖2’-OH甲基化5’帽子功能：稳定mRNA，不被5’核酸外切酶水解；翻译起始的识别功能；有助于mRNA转运13整理ppt加5’帽子的方法

capI结构RNA三磷酸酶鸟苷酰转移酶鸟嘌呤7-甲基转移酶2’-O-甲基转移酶14整理ppt

（2）3’尾巴的形成（tailing）:

3’尾巴：真核生物mRNA的3’–端大都有20–200个腺苷酸构成的polyA长链。形成于核内加工时期。作用：稳定3’-端，mRNA的polyA尾巴越长，可供降解的时间越长，寿命越长。与核内向细胞质转移有关。不是所有真核生物蛋白mRNA都有polyA尾巴，如组蛋白15整理ppt真核生物的mRNA在3’–端存在保守的加尾信号（AAUAAA）RNaseIII识别加尾信号，在其下游10~30Nt处切断，mRNA脱落。由多聚腺苷酸聚合酶加上20~200Nt的polyA尾巴。RNaseIII多聚腺苷酸聚合酶mRNARNA聚合酶II

3’尾巴的形成:16整理ppt（3）mRNA的内部甲基化：

m6A，在hnRNA加工中起识别作用，不是翻译所必需。（4）内含子的切除及RNA拼接：

核内小分子RNA与拼接体17整理ppt三.RNA拼接：真核RNA的内含子切除以及拼接等方式是多样化的是基因表达调控的一个重要方面1）类型I自我拼接(groupIself-splicing)2）类型II自我拼接(groupIIself-splicing)3）核mRNA的拼接体的拼接(nuclearmRNAspliceosomal)4）核内tRNA前体的酶促拼接(nucleartRNAenzymatic)5）反式拼接（trans-splicing)6）选择性拼接（alternativesplicing)

18整理ppt1）类型I自我拼接（groupIself-splicing)：1983年，CechT发现。1989年获得Nobel化学奖嗜热四膜虫26srRNA前体（413Nt），在成熟过程中无需酶的催化，但需5’-GMP和Mg2+,是由其IVS(内含子）自我催化完成的。

5’-GMP3’5’

OH

G5’3’

(G-IVS)

G

Mg2+

Mg2+

L19-IVS(395nt)两次环化切除19nt5’3’19整理ppt2）类型II自我拼接（groupIIself-splicing)1982，AltmanS。1989年获得Nobel化学奖II型内含子（RNAaseP的M1RNA)在催化剪接反应时不需要鸟苷酸，但需要Mg2+5’3’3’A2’-OH

Mg2+5’OH3’A2’-OH3’

Mg2+5’3’+A2’-OH3’OH20整理ppt3)核mRNA拼接体拼接

（nuclearmRNAsplicesomalsplicing)真核生物hnRNA的拼接是由核内小分子RNA（snRNA）来承担。snRNA：100-300个Nt的RNA，U含量高的称为U系列snRNA。其中除了U3以外，U1–

U6都参与hnRNA的加工。拼接体（splicesome）：snRNA与蛋白构成核糖核蛋白（snRNP），并组装成为50-60S的椭球体。21整理pptCAUUCAUAUGAUGU外显子1外显子2GUAAGUAUACUACAAG5’3’内含子U1U2

拼接体（splicesome）分支点拼接体22整理ppt

真核生物mRNA的拼接过程

拼接体识别、结合hnRNA内含子5’及3’区域外显子靠近，形成套索RNA(lariatRNA)

两步转酯反应，切去内含子，连接外显子23整理ppt4)核内tRNA前体的酶促拼接

（nucleartRNAenzymaticsplicing)催化酵母tRNA前体拼接的酶识别的不是内含子的序列，而是特定的二级结构内含子外显子1外显子2核酸内切酶2’,3’环磷键+5’-OH环磷酸二酯酶激酶+ATPA-P-PP2’3’OHP2’3’OHP2’3’P3’P连接酶磷酸酯酶24整理ppt5）反式拼接：顺式拼接：分子内的拼接反式拼接：生物体内存在的分子间的拼接方式。较少见

例如：锥虫的多种mRNA-GU-A-AGmRNA前导序列-A-AGGU|右侧内含子左侧内含子25整理ppt6）选择性拼接（alternativesplicing)

：选择性拼接（alternativesplicing)

：在不同发育阶段或不同组织器官中，mRNA以不同的方式拼接。同源蛋白：经选择性拼接得到的不同蛋白产物。例如：降钙素和降钙素基因相关肽

polyApolyA脑中肾上腺1-2-3-4（降钙素）1-2-3-56（降钙素基因相关肽）exon12345626整理ppt②哺乳动物载脂蛋白B（ApoB）：在肝脏正常合成ApoB100。而在小肠中，CU，导致终止密码UAA出现，肽链合成提前终止，合成ApoB48。RNA编辑：改变RNA编码序列的方式RNA编辑类型：多种①U的插入与删除：指导RNA(guideRNA,gRNA)为模板的转酯反应。例如：锥虫线粒体mRNA插入4个U，校正了基因-1移码突变四RNA编辑（RNAediting）与化学修饰：3’5’UUU-OHUU3’UUUUU5’OH3’5’U第一次转酯第二次转酯③脑Glu受体亚基mRNA：AI，多个GlnArgRNA编辑意义：修正有害基因突变；增加基因产物多样性；与组织发育与分化的有关的调控方式

27整理ppt五RNA再编码（RNArecoding)RNA再编码：对RNA编码序列阅读方式的改变主要方式：利用校正tRNA。（校正tRNA：是变异的tRNA，反密码子环碱基发生改变，或是决定tRNA特异性即个性的碱基发生改变，从而改变了译码规则，使错误的编码信息受到校正。消除错义、无义和移码突变的影响。）

①改变反密码子或决定tRNA特异性的碱基②阅读二联体或四联体密码子方式，修正移码突变28整理ppt第三节RNA指导下的

RNA和DNA的合成一RNA复制(RNAreplication)：主要存在于RNA病毒中以RNA为模板，合成互补RNA的过程。条件：RNA复制酶催化（RDRP，专一性极高）需要RNA模板、4种核糖三核苷酸和Mg2+复制进行的方向5’3’。

29整理ppt1.噬菌体QRNA的复制：噬菌体QRNA：4500Nt,可编码3-4个蛋白。基因有重叠。外壳蛋白在转录时发生通读，则产生A1蛋白。噬菌体QRNA本身(+链)是mRNA，可以直接翻译。只有一个起始密码是开放的复制酶亚基合成后，利用宿主的成分装配复制酶。30整理ppt2噬菌体Q复制酶组成：噬菌体Q复制酶专一性极高，只作用于自身RNA，对宿主RNA及其它RNA无反应。并且强烈抑制核糖体与RNA结合。31整理ppt首先酶吸附在QRNA3’端，以Q正链为模板合成负链；再以负链为模板合成大量正链，并合成成熟所需要的蛋白。需要HFI和HFII速度35Nt/s不需HFI和HFII32整理pptQ噬菌体复制特点：（1）尽可能利用宿主成分，简化自身基因组。（2）各种蛋白成分效率高，兼具多种功能：

Q复制酶:复制专一性极高；蛋白合成阻遏物外壳蛋白：结构蛋白；复制酶合成的调节蛋白（3）基因表达采用时序调控方式33整理ppt3病毒RNA复制的主要方式：（1）含正链RNA的病毒：噬菌体Q、灰质炎病毒先合成复制酶及相关蛋白

RNA复制蛋白合成装配（2）含负链RNA及复制酶的病毒：狂犬病病毒利用自身携带的复制酶合成正链RNA合成病毒蛋白（3）含双链及复制酶的病毒：呼肠孤病毒以双链为模版不对称转录出正链RNA合成病毒蛋白RNA复制（4）致癌RNA病毒：一般含有两条相同正链RNA（二倍体）先经过逆转录合成DNAmRNA蛋白34整理ppt二RNA逆转录（reversetranscription）逆（反）转录：以RNA为模板合成DNA1逆转录酶(reversetranscriptase)：依赖RNA的DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase,RDDP)、RNA指导的DNA聚合酶(RNA-directedDNApolymerase)

1970年TeminH.等发现逆转录酶，证实前病毒学说。1975年，获得诺贝尔医学/生理学奖35整理ppt2逆转录酶的性质：需引物（tRNA)、模板和Mg2+等二价阳离子。按照5’3’合成是多功能酶：（1）具有RNA指导的DNA聚合酶活力（RDDP)（2）具有DNA指导的DNA聚合酶活力(DDDP)（3）具有核糖核酸酶H(RNaseH，核酸外切酶)活性(专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA)以mRNA为模板(具有polyA尾巴，可以polydT为引物)合成的互补DNA——cDNA36整理pptDDDP5

cDNA的

合成37整理ppt3逆转录的基本过程：

以RNA为模板（无翻译功能）→RNA-DNA杂交体→RNaseH水解去除RNA→以cDNA为模板复制DNA双链→利用自身长末端重复序列（longterminalrepeat,LTR）整合到宿主DNA→前病毒（provirus）→转录→翻译

38整理ppt3两种不同的逆转录病毒（逆病毒）：（1）逆转录RNA病毒：HIV、致癌病毒以RNA为基因携带者：两条+链，5’端以氢键结合，有5’帽子、3’-polyA尾巴，5’端附近带有一个宿主tRNA引物生活周期：RNA（+）逆转录DNA(-)RNA(+)蛋白负链DNA合成的引物：tRNA（2）乙型肝炎病毒（HBV）：以DNA为基因携带者（带缺口的双链环状DNA）生活周期：DNA()

转录RNA（+）逆转录DNA(-)DNA()

负链DNA合成的引物：蛋白两种病毒颗粒都携带逆转录酶39整理ppt三逆转座子（retroposon)

逆转座子：转座需要以RNA为中间体，经逆转录再分散到基因组中的可移动因子