细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。2.实验步骤：2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。2.3接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。注意避免气泡的产生。2.4培养细胞：常规培养12-48小时。24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.5结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20%FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20%FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。对于细胞侵袭实验，Matrigel在4℃过夜融化，然后用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel，37℃温育4-5小时使其干成胶状，后续步骤同迁移实验。注意事项包括Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷，铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡，其他注意事项同迁移试验。细胞侵袭实验是一种常用的细胞学实验，用于研究细胞的侵袭能力。在进行实验前，需要准备好细胞悬液和Matrigel，然后按照以下步骤进行操作。首先，将每个transwell的上室加入100ul细胞悬液，然后加入药物刺激。接下来，在下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子，并将整个实验放入37℃的培养箱中，孵育20-24小时。孵育结束后，取出transwell，用PBS洗涤2次，然后使用5%戊二醛固定，4℃保存。接着，再次用PBS洗涤2次，加入0.1%结晶紫染色，室温下染色0.5小时，然后再次用PBS洗涤2次。最后，使用棉球擦去上表面的细胞，使用显微镜观察并计数，拍摄照片并记录结果。对于侵袭实验，需要在无血清培养基中加入Matrigel，并将其混合均匀。然后将每个transwell的上室加入100ul细胞悬液，下腔室中加入600ul无血清条件培养基，将整个实验放入37℃的培养箱中，孵育20-24小时。孵育结束后，取出transwell，用PBS洗涤2次，使用5%戊二醛固定，4℃保存。接着，再次用PBS洗涤2次，加入0.1%结晶紫染色，室温下染色0.5小时，然后再次用PBS洗涤2次。最后，使用棉球擦去上表面的细胞，使用显微镜观察并计数，拍摄照片并记录