复旦药学院2007级课件生物化学翻译生化

1第十六章蛋白质生物合成2蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。3翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的模板是模板与氨基酸之间的接合体是蛋白质合成的原料是蛋白质合成的场所是

核糖体mRNAtRNA20种氨基酸4tRNA运送氨基酸到对应的mRNA密码子上5rRNA和蛋白质提供了一个将特定的氨基酸聚合成肽链的装置mRNA代表蛋白质的核苷酸序列一、遗传密码——三联子（一）三联子密码定义mRNA链上每三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为密码子或三联子密码(triplet

coden)

。6mRNA5’

GCU

AGU

ACA

AAA

CCU

3’mRNA5′3′mRNA5′3′mRNA5′3′

AUCGACCUGAGC4

20

(×)AUCGACCUGAGC42=16

20

(×)AUCGACCUGAGC43=64

20

(√)核甘酸序列氨基酸序列7（二）三联子密码破译Crick用T噬菌体为实验材料，研究基因的碱基增加或减少对其编码的蛋白质会有什么影响。8(-)(-)(-)一次删去5’-GUA

↓↓↓UAC

GGA

U………3’

读码框不变9Crick通过实验证明了遗传密码中三个碱基编码一个氨基酸，阅读密码的方式是从一个固定的起点开始，以非重叠的方式进行，编码之间没有分隔符。Francis

Harry

Compton

Crick1916.6.8——2004.7.281011Nirenberg以寡聚核苷酸为模板指导多肽的合成,寻找到了破译遗传密码的途径Khorana以多聚物指导多肽的合成，加快了破译遗传密码的步伐.Marshall

W．Nirenberg

Har

Gobind

Khorana1968年诺贝尔生理学或医学奖至1966年，20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清。遗传密码的破译，即确定代表每种氨基酸的具体密码。12AUG是最常见的起始密码子，同时编码Met。UAA、UGA、UAG为终止密码子，也称为无义密码子，没有对应的tRNA的反密码子与之结合，但能被蛋白质合成的终止因子和释放因子所识别，终止肽链合成。UAA又被称作赭石(ochre)密码，UGA称作乳白石

(opal)密码，UAG称作琥珀(amber)密码，这些名称来源于最初发现到这些终止密码子的基因的名称。13（三）遗传密码的性质141、简并性4种核苷酸可组成64个密码子，除了3个不编码氨基酸的终止密码子UAA、UGA和UAG外，61个是编码氨基酸的密码子，对应于20种氨基酸。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymouscodon），通常同义密码子之间不同的在第三个碱基。15由于存在密码子的简并性，mRNA序列中一个核苷酸的改变不一定会影响其编码多肽链中氨基酸的性质和序列，这就减少了变异对生物的影响。162、摆动性17转运氨基酸的tRNA上的反密码子在核糖体内需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，这种现象称为密码子的摆动性。使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。181966年，Crick提出摆动假说（wobblehypothesis），解释了反密码子中某些稀有成分（如次黄嘌呤I）的配对，以及许多氨基酸有2个以上密码子的问题。一个tRNA究竟能识别多少个密码子是由反密码

子的第一位碱基（对应于密码子的第三位碱基）的性质决定的，反密码子第一位为A或C时只能

识别1种密码子，为G或U时可以识别2种密码子，为I时可识别3种密码子。19密码子、反密码子配对的摆动现象20tRNA反密码子第1位碱基IUGACmRNA密码子第3位碱基U,

C,

AA,

GU,

CUG多个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA。原核生物中大约有30-45种tRNA，真核细胞中可能存在50种tRNA。213、通用性与特殊性22蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用，称为通用遗传密码，对进化过程中生物物种的稳定性及物种之间的相互联系和沟通是十分重要的。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体，存在各自特有的基因组，编码10-20个氨基酸。生物密码子线粒体DNA编码的氨基酸核DNA编码的氨基酸所有UGA色氨酸终止子酵母CUA苏氨酸亮氨酸果蝇AGA丝氨酸精氨酸哺乳类AGA/G终止子精氨酸哺乳类AUA甲硫氨酸异亮氨酸23线粒体与核DNA密码子使用情况的比较4、偏爱性24多数氨基酸有一个以上的密码子，但这些密码子的使用频率各不相同，称之为遗传密码的偏爱性。原核生物和真核生物有各自的密码子偏爱性；某一种密码子的使用频率与细胞内相应的tRNA丰度是一致的。5、连续性25编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致移码突变(frameshift

mutation)。26生物体内的各种蛋白质都是生物体内利用约20种氨基酸为原料自行合成的。参与蛋白质生物合成的各种因素构成了蛋白质合成体系，该体系包括：①mRNA：作为蛋白质生物合成的模板，决定多肽链中氨基酸的排列顺序；②tRNA：搬运氨基酸的工具；③核糖体（又名核蛋白体）：蛋白体生物合成的场所；④酶及其他蛋白质因子；⑤供能物质及无机离子。27二、蛋白质的生物合成mRNA是蛋白质生物合成过程中直接指令氨基酸掺入的模板，是遗传信息的载体。28（一）生物合成的模板——mRNA原核细胞mRNA的结构特点5´3´顺反子

顺反子

顺反子SD区特点①

半衰期短② 许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在，编码多个蛋白质。③ AUG作为起始密码；AUG上游4～13个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区，是mRNA和核糖体识别、结合的位点。29UAAGGAGGSD

(Shine-Dalgarno)

Sequence原核生物mRNA的起始密码子AUG上游4-13个核苷酸以外有一段含嘌呤核苷酸较多的保守序列，它是mRNA和核糖体识别、结合的位点。SD序列与核糖体小亚基16SrRNA上一段富含嘧啶核苷酸的保守序列互补，核糖体借此判定

mRNA的翻译起始位点。30SD

Sequencetranslation3132真核细胞mRNA的结构特点5´

“帽子”PolyA

3´单顺反子m7G-5´ppp-N-3

´

p帽子结构功能① 使mRNA免遭核酸酶的破坏② 使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质③

被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。Poly(A)尾巴的功能① 是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式② 它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性AAAAAAA-OHKozakSequence真核生物起始密码子常处于-CCACCAUGG-序列之中，这段保守序列的存在能增加翻译起始的效率，这段序列称为Kozak序列。33(二)

tRNA的结构、功能与种类34tRNA不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体，所以，它又被称为第二遗传密码。1.

tRNA的结构二级结构：三叶草形35三级结构：“L”形361、解读mRNA的遗传信息2、运输的工具，运载氨基酸tRNA有两个关键部位：3’端CCA：接受氨基酸，形成氨基酰-tRNA。●与mRNA结合部位—反密码子部位2.

tRNA的功能37核糖体的结构核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占

2/5。原核生物、真核生物细胞质及细胞器中的核糖体存在着很大差异。38(三)核糖体的结构与功能核糖体的组成39多核糖体(polyribosome)蛋白质合成过程中，往往几个核糖体同时附着在同一条mRNA链上，形成“多核糖体”结构。每个核糖体可以单独完成一条肽链的合成，这样一条mRNA链可同时启动多条肽链的合成，大大提高蛋白质合成的效率。40多核糖体41核糖体分子中可容纳两个

tRNA和约40bp长的mRNA。一条mRNA链上结合核糖体的数目取决于

mRNA的长度。2.核糖体的功能：42在多肽合成过程中，由不同的tRNA将相应的氨基酸带到蛋白质合成部位，并与mRNA进行专一性的相互作用，以选择对信息专一的AA-tRNA。核糖体还必须能同时容纳另一种携带肽链的tRNA，即肽基tRNA（peptidyl-tRNA），并使之处于肽键易于生成的位置上。在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。mRNA结合部位——小亚基结合或接受AA-tRNA部位（A位）——大、小亚基结合或接受肽基tRNA的部位（P位）——大、小亚基空tRNA脱出位点(E位)——大亚基此外，在大亚基上还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点以及肽基转移酶/转肽酶的活性功能区。4344核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等，

A位、P位、E位及转肽酶中心等主要在大亚基上。tRNA上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点，而tRNA上的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对，所以分子中两个不同的功能基团是最大限度分离的。45(四)蛋白质合成的过程46氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止蛋白质前体的加工4原核生物蛋白质合成各阶段的主要成分简表m71.氨基酸的活化氨基酸+tRNA氨基酰-tRNA48ATPAMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶分两步进行：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA

+

ATP

+

E

→

E-AA-AMP

+

PPi第二步是氨酰基转移到tRNA3'末端腺苷残基的2'或3'-羟基上。E-AA-AMP

+

tRNA

→

AA-tRNA

+

E

+

AMP49tRNA与酶结合的模型tRNA氨基酰-tRNA合成酶AA氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proofreadingactivity)，避免错误的氨基酸进入蛋白质。用tRNAGly表示将要接受Gly的tRNA,用Ala-tRNAAla

，Met-tRNAMet表示对应的氨基酰-tRNA。50tRNA的种类51起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。真核生物：起始密码子AUG所编码的氨基酸是Met，起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。原核生物：起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet(由10N-甲酰四氢叶酸提供甲酰基)52原核生物中，起始氨基酸是：起始AA-tRNA是：真核生物中，起始氨基酸是：起始AA-tRNA是：53甲酰甲硫氨酸

fMet-tRNAfMet甲硫氨酸Met-tRNAMetMet-tRNAiMet只能识别mRNA起始密码子AUG；Met-tRNAmMet只能携带Met进入正在延伸的肽链，不能识别起始密码子AUG同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别。542.翻译的起始55蛋白质合成的起始是指在模板mRNA编码区5’端形成核糖体-mRNA-起始tRNA复合物并将(甲酰)甲硫氨酸放入核糖体P位点。原核生物（细菌）为例：所需成分：30S小亚基、50S大亚基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻译起始因子：IF1(促进IF2和IF3的活性)、IF2(在

30S亚基存在时有很强的GTPase活性)、IF3(促进

mRNA与30S亚基结合)原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合,形成70S起始复合物。56IF-357IF-1翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步：1.核糖体大小亚基分离2、30S小亚基通过与SD序列作用，与mRNA模板相结合。AUG5'3'IF-358IF-1S-D序列59IF-3IF-1IF-2

GTP603.在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。AUG5'3'IF-3IF-1IF-2

GGDTPPPi614、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。AUG5'3'IF-3IF-1AUG5'3'GDP62IF-2-GGTTPPi真核生物翻译起始的特点●核糖体较大,形成的起始复合物为８０Ｓ；●起始因子比较多，用eIF表示；Met-tRNAiMet真核生物mRNA没有核糖体结合位点序列，但

mRNA的5’端帽子结构和3’端polyA都参与起始识别，形成翻译起始复合物，如帽子结合蛋白

(cap-bindingprotein,CBP)能结合mRNA的帽子结构，并促使mRNA与40S大亚基结合。63真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物)原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA的5’末端结合，并向下游移动直到遇到第一个AUG密码子，该过程称为扫描，最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物。64met40S60SMetMet40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、eIF-6①elF-3②各种elF释放GDP+PielF-5④ATPelF4E,elF4G,elF4A,elF4B,PABADP+Pi③MetMet-tRNAMet-elF-2

-GTP真核生物翻译起始复合物形成6过5

程43S48S80S生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：进位（AA-tRNA与核糖体结合）、成肽（肽键的生成）和转位。延伸因子(elongation

factor,

EF)

：原核生物：EF-T

(EF-Tu,

EF-Ts),

EF-G真核生物：EF-1、EF-2663.肽链的延伸(1)AA-tRNA与核糖体A位点的结合67需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts（EF-1α/EF-1β/EF-1γ）两种延伸因子氨基酰-tRNA首先与EF-

Tu·GTP形成复合物，进入核糖体的A位，GTP水解释放EF-Tu

·GDP，在EF-Ts的辅助下与另一分子的GTP作用重新生成EF-Tu

·GTP，进入新一轮循环。6869通过延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-Tu·GTP复合物EF-Tu-GDP

+

EF-TsEF-Tu-Ts

+

GDPEF-Tu-Ts

+

GTPEF-Tu-GTP

+

EF-Ts重新参与下一轮循环由于EF-Tu只能与fMet-tRNAi以外的其他AA-tRNA起反应，所以起始tRNA不会被结合到A位上，mRNA内部的AUG不会被起始tRNA读出，肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸。70(2)肽键形成在转肽酶/肽基转移酶的催化下，P位上的氨基酰C-末端与A位上氨基酰-tRNA的氨基之间形成肽键。71(3)移位72由于P位上空的tRNA通过进入E位离开核糖体，P位空出，新生的肽酰基tRNA从A位移到P位，核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子。需要消耗GTP，并需EF-G(EF-2)延伸因子延长因子EF-G有转位酶(

translocase

)活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3'侧移动

。73AUG5'3'fMetfMetTuGTP7475翻译延伸因子的种类和功能76原核生物功能真核生物EF-Tu/EF-Ts协助AA-tRNA进入A位EF-1α/EF-1β/EF-1γEF-G转位酶，协助肽基-

tRNA由A位移至P位，释放游离的tRNAEF-2当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解

P位上多肽链与tRNA之间的二酯键，释放新生的肽链和tRNA，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。774.肽链的终止原核肽链合成终止过程78终止因子RF1：识别终止密码子UAA和UAGRF2：识别终止密码子UAA和UGARF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，协助肽链的释放（原核生物）79真核生物只有一个终止因子（eRF）5.肽链的折叠80从核糖体中新合成的多肽链一般不具有生物活性，必须经过复杂的加工才能转变成具有天然空间

结构的活性蛋白质。Anfinsen根据著名的核糖核酸酶在变性并还原后可以自发地氧化折叠以恢复天然结构和全部生物活性的实验，提出蛋白质中的氨基酸序列决定其空间结构，即蛋白质的一级结构决定其三维结构的假设。Christian

B.

Anfinsen

——1972年诺贝尔化学奖81肽链折叠是指从多肽链的氨基酸序列形成具有正确三维空间结构的蛋白质的过程。蛋白质折叠不仅包括新合成的肽链的折叠，也牵涉到诸如蛋白质在细胞中、跨膜运送前后的去折叠和再折叠过程。82新生肽链折叠的假说，强调了新生肽链折叠的结构信息存在于组成多肽链的氨基酸序列中，既考虑到多肽链中特定氨基酸残基的近程相互作用，又重视特定氨基酸残基的远程相互作用在新生肽链折叠中的重要贡献。邹承鲁1923.5.17－2006.11.2383体内多肽链的折叠目前认为至少有两类蛋白质参与，称为助折叠蛋白:（1）酶：蛋白质二硫键异构酶（PDI）肽链脯氨酸异构酶（PPI）；（2）分子伴侣84与蛋白质折叠有关的折叠酶：–蛋白质二硫键异构酶（PDI）

PDI定位在内质网管腔内，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应，从而催化蛋白质二硫键的形成、还原（断裂）或重排（异构化）,最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。–肽链脯氨酸异构酶（PPI）

PPI广泛分布于各种生物体及各种组织中，多数定位于胞浆，在细胞中催化肽基脯氨酰的顺式与反式异构体的相互转变。85translationLasky于1978年首先提出分子伴侣（mulecularchaperone）的概念，这是一类在细胞内能帮助新生肽链正确折叠与装配组装成为成熟蛋白质，但其本身并不构成被介导的蛋白质组成部分的一类蛋白因子，在原核生物和真核生物中广泛存在。86分子伴侣的作用：87封闭暴露的疏水区域，保护蛋白质不受其他蛋白的相互作用，为蛋白质折叠创造一个无干扰的隔离环境；蛋白质合成开始时，防止新生肽链在完成折叠前的相互聚合；识别错误折叠的变性蛋白，使其复性或降解。蛋白质合成后的折叠加工是蛋白质正确发挥功能的必需“蛋白质折叠异常与疾病”——阿兹海默氏症(Alzheimer's)、囊肿纤维化（Cysticfibrosis）、疯牛病(MadCow,BSE),

甚至许多癌症的起因都是蛋白质的非正常折叠。当蛋白质非正常折叠，可能凝聚起来(“