核酸的分离纯化

核酸的分离纯化第1页，课件共85页，创作于2023年2月DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作第2页，课件共85页，创作于2023年2月核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度第3页，课件共85页，创作于2023年2月核酸分子提取的技术路线I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第4页，课件共85页，创作于2023年2月第一节核酸分离纯化的设计及原则第二节基因组DNA的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化第四节RNA的分离纯化第五节核酸的保存与鉴定第5页，课件共85页，创作于2023年2月第一节核酸分离纯化的设计及原则

第6页，课件共85页，创作于2023年2月一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存第7页，课件共85页，创作于2023年2月（一）材料与方法的选择

不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择第8页，课件共85页，创作于2023年2月

1.保持核酸碱基序列的完整性

2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度

3.保持核酸的完整性

尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间

尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（二）选择原则一、材料与方法的选择第9页，课件共85页，创作于2023年2月二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第10页，课件共85页，创作于2023年2月（一）核酸的释放

DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。第11页，课件共85页，创作于2023年2月第12页，课件共85页，创作于2023年2月

应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等

2.非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质

3.加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化第13页，课件共85页，创作于2023年2月（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除第14页，课件共85页，创作于2023年2月三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存第15页，课件共85页，创作于2023年2月（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定2.纯度鉴定3.完整性鉴定第16页，课件共85页，创作于2023年2月紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。

1.浓度鉴定第17页，课件共85页，创作于2023年2月

各种碱基的紫外吸收光谱第18页，课件共85页，创作于2023年2月

荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。第19页，课件共85页，创作于2023年2月EB与DNA的结合第20页，课件共85页，创作于2023年2月第21页，课件共85页，创作于2023年2月

紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。

2.纯度鉴定第22页，课件共85页，创作于2023年2月1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0第23页，课件共85页，创作于2023年2月荧光光度法：

EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。第24页，课件共85页，创作于2023年2月琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状

3.完整性鉴定第25页，课件共85页，创作于2023年2月DNA的降解第26页，课件共85页，创作于2023年2月

完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低

第27页，课件共85页，创作于2023年2月28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染第28页，课件共85页，创作于2023年2月第29页，课件共85页，创作于2023年2月（二）核酸的保存

1.DNA的储存2.RNA的储存第30页，课件共85页，创作于2023年2月

溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。

TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时DNA易变性。

1.DNA的保存第31页，课件共85页，创作于2023年2月

2.RNA的保存

RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃

保存

RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理第32页，课件共85页，创作于2023年2月第二节真核基因组DNA的分离纯化

第33页，课件共85页，创作于2023年2月生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法

哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第34页，课件共85页，创作于2023年2月基因组DNA的提取

酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀第35页，课件共85页，创作于2023年2月血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试剂盒细胞基因组DNA试剂盒第36页，课件共85页，创作于2023年2月一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收第37页，课件共85页，创作于2023年2月

一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品第38页，课件共85页，创作于2023年2月第39页，课件共85页，创作于2023年2月二、甲酰胺解聚法

1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。第40页，课件共85页，创作于2023年2月

三、玻棒缠绕法玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来第41页，课件共85页，创作于2023年2月四、其它方法

有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法广泛使用。

1.异丙醇沉淀法

2.玻璃珠吸附法第42页，课件共85页，创作于2023年2月五、DNA片段的纯化常用的纯化方法：有机溶剂抽提法柱层析法（columnchromatography）第43页，课件共85页，创作于2023年2月第44页，课件共85页，创作于2023年2月六、DNA片段的回收原则与要求:

1.提高片段的回收率

2.清除回收的DNA样品中的杂质第45页，课件共85页，创作于2023年2月（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段第46页，课件共85页，创作于2023年2月1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法

（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段第47页，课件共85页，创作于2023年2月（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。第48页，课件共85页，创作于2023年2月第三节质粒DNA的提取与纯化

第49页，课件共85页，创作于2023年2月质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。第50页，课件共85页，创作于2023年2月第51页，课件共85页，创作于2023年2月质粒特性1.分子相对小2.含有高效的自主复制成分3.不相容性4.转移性5.选择的标记6.限制性内切酶单一切。第52页，课件共85页，创作于2023年2月第53页，课件共85页，创作于2023年2月质粒DNA的提取和纯化1．细菌的培养

先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。质粒DNA的小量制备2-5ml质粒DNA的大量制备500ml{第54页，课件共85页，创作于2023年2月2．细菌的收集细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净

第55页，课件共85页，创作于2023年2月 碱裂解法 煮沸法

SDS裂解法

Triton-溶菌酶法3．细菌的裂解方法4．质粒DNA的提取

适用于大质粒DNA

不适宜含糖高的菌株如HB101第56页，课件共85页，创作于2023年2月二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其他方法一、碱裂解法五、质粒DNA的纯化第57页，课件共85页，创作于2023年2月一、碱裂解法

在强碱（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。第58页，课件共85页，创作于2023年2月细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中第59页，课件共85页，创作于2023年2月第60页，课件共85页，创作于2023年2月二、煮沸裂解法

将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。第61页，课件共85页，创作于2023年2月质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA第62页，课件共85页，创作于2023年2月三、SDS裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA第63页，课件共85页，创作于2023年2月由于条件温和，SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。第64页，课件共85页，创作于2023年2月四、其他方法（二）牙签少量制备法(一)小量一步提取法第65页，课件共85页，创作于2023年2月直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析(一)小量一步提取法第66页，课件共85页，创作于2023年2月（二）牙签少量制备法用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定第67页，课件共85页，创作于2023年2月五、质粒DNA的纯化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱层析法第68页，课件共85页，创作于2023年2月

在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面RNA密度大而沉于管底各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部EB-CsCl密度梯度离心法第69页，课件共85页，创作于2023年2月第70页，课件共85页，创作于2023年2月不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。

染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较多

闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度下降较少

第71页，课件共85页，创作于2023年2月第72页，课件共85页，创作于2023年2月第四节真核细胞RNA的分离纯化

第73页，课件共85页，创作于2023年2月细胞RNA的含量

每个细胞的RNA量约为10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA

其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…第74页，课件共85页，创作于2023年2月

二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法

三、商品化试剂单相裂解法

四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境第75页，课件共85页，创作于2023年2月一、RNA制备的条件与环境RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复第76页，课件共85页，创作于2023年2月去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制备成功与否的关键在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内RNase的活性第77页，课件共85页，创作于2023年2月

选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠第78页，课件共85页，创作于2023年2月联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA