第3章　第1节　重组DNA技术的基本工具

第1节重组DNA技术的基本工具1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。1．生命观念——运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。2．社会责任——关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。一、基因工程及其诞生与发展1．基因工程的概念(1)操作场所：生物体外。(2)操作技术：转基因等技术。(3)操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(4)操作水平：DNA分子水平。2．基因工程的诞生和发展(1)基因工程的诞生①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。②1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。④20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。⑤1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。(2)基因工程的发展①1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。③1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。④1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。⑤21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。二、重组DNA技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”(1)来源：主要来自原核生物。(2)功能：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(3)结果：产生黏性末端或平末端。(4)应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。2．DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)种类[填表]种类比较E．coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能连接黏性末端既可以连接黏性末端，又可以连接平末端3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)质粒①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。②质粒适于作基因运载体的特点a．质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。c．人工改造的质粒常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。(2)噬菌体、动植物病毒等。三、DNA的粗提取与鉴定1．实验原理(1)DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。(2)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。2．方法步骤(1)研磨：取30g洋葱切碎，倒入10mL研磨液研磨。(2)除杂：漏斗中垫上纱布过滤后，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，也可以在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液(3)提取：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。方法一：用玻璃棒沿一个(填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。方法二：10000r/min的转速下离心5min，取沉淀物晾干。(4)鉴定：项目AB2mol/L的NaCl溶液5mL丝状物或沉淀物不加加入二苯胺试剂4mL沸水中加热5min现象无色蓝色1．用不同的限制酶切割DNA分子可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶，同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。提示：不相同。DNA连接酶连接的是DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。(正确的打“√”，错误的打“×”)1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 (√)2．DNA聚合酶也可以用作重组DNA技术的工具。 (×)提示：重组DNA技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。 (×)提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 (√)5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 (×)提示：E．coliDNA连接酶不能连接平末端。6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 (√)基因工程的工具酶1．限制性内切核酸酶(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面。①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②能够切割特定序列中的特定位点。(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如eq\a\vs4\al(GC,CG)eq\b\lc\|(\a\vs4\al\co1(GC,CG))以中心线为轴，两侧碱基互补对称；eq\a\vs4\al(CCAGG,GGTCC)以eq\a\vs4\al(A,T)为轴，两侧碱基互补对称。(3)作用产物：黏性末端或平末端。①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时形成的，如图所示：②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：2．DNA连接酶(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。(2)连接方式：DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。3．与DNA相关的五种酶的比较名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E．coliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。1．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是()A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸C．E．coliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNAB[DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确；E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。]2．下列各种酶及其作用对应关系不正确的是()A．限制酶——识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开B．RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译C．DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起D．DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上B[限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，A正确；RNA聚合酶与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误；DNA连接酶将分开的DNA片段通过特定的末端连接在一起，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，C正确；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键，D正确。]几种酶的作用部位图解(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶：限制酶(断开)、DNA连接酶(形成)和DNA聚合酶(形成)。(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶(断开)。基因工程中常用的载体1．特点质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的环状双链DNA分子。2．本质质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型DNA分子，不是细胞器。3．质粒作为载体所具备的条件条件分析稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择无毒害作用避免受体细胞受到损伤4．标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示：细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如动植物病毒、噬菌体等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是()A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B．具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择A[作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]2．某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是bA[①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。]某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。A酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)2100；1400；1000；5001900；200；800；600；1000；500本案例考查演绎与推理的科学思维。(1)该DNA分子上有几个a酶识别和切割的位点？有几个b酶识别和切割的位点？(科学思维)(2)a酶和b酶切出的黏性末端能相互连接吗？(科学思维)提示：(1)该DNA分子上有3个a酶识别和切割的位点；有2个b酶识别和切割的位点。(2)a酶和b酶切出的黏性末端相同，因此能相连。[课堂小结]知识网络构建要点强化识记结论语句(1)基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。(2)重组DNA技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。(3)限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。(4)E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。(5)质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。(6)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。1．下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是()A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNAC．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同D．限制酶只能从原核生物中提取B[一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。]2．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是()A．DNA连接酶连接的是两个DNA片段碱基对之间的氢键B．DNA连接酶连接的是DNA单链上的磷酸和脱氧核糖C．DNA连接酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端D．E．coliDNA连接酶能将双链DNA片段互补的平末端连接起来B[DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，A错误；DNA连接酶连接的是DNA双链片段两个脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖，B正确、C错误；E．coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，D错误。]3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是()A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核(区)外的细胞质基质中D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制A[质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。]4．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C．预冷的酒精溶液可用来粗提取DNAD．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热A[兔属于哺乳动物，其成熟红