大学本科毕业论文多肽材料在药物释放领域的应用

PAGEPAGE3目录摘要 3Abstract 4前言 51.多肽类药物研究开发新进展 51.1多肽类物质研究改革 51.2多肽药物的主要功能及重要性 71.3世界多肽类新药开发上市情况 71.3.1多肽类疫苗研究大有希望 71.3.2抗肿瘤多肽 81.3.3抗菌活性多肽 81.3.4抗病毒多肽 81.3.5多肽导向药物 81.3.6作用于心血管的多肽类药物 91.3.7植物多肽 91.3.8诊断用多肽 102.多肽的合成方法 102.1碳二亚胺法合成多肽 102.1.1碳二亚胺型 112.1.2鎓盐型 112.2液相多肽合成 122.3固相多肽合成 122.4磷酸化多肽合成 122.5自然化学连接 133.蛋白质及多肽类药物结构稳定性的研究进展 133.1影响蛋白质和多肽药物稳定性的主要因素 133.1.1蛋白酶因素的影响 133.1.2蛋白质物理或化学上的性质变化 143.1.3受体介导的清除 143.1.4肾脏的过滤消除 143.2蛋白质和多肽药物获得稳定性的研究方法 143.2.1化学修饰 143.2.1.1糖基化反应 153.2.1.2酯化反应 153.2.1.3酰化反应 153.2.1.4取代反应 163.2.2延长肽链 163.2.3形成环肽 163.2.4微囊包埋 174.多肽及蛋白质类药物在药物释放领域的研究进展 184.1多肽及蛋白质类药物智能释放系统的研究 184.1.1单一响应性智能释放系统 184.1.1.1温敏性智能释放系统 184.1.1.2酸敏性智能控释系统 194.1.1.3电场敏感性智能控释系统 204.1.2双重响应性智能释放系统 204.1.2.1温度、pH值敏感性智能释放系统 204.1.2.2光、热敏感性智能释放系统 214.1.2.3pH值、阳离子敏感性智能释放系统 214.2缓释微球制剂的研究进展 224.2.1清蛋白微球 224.2.2聚乳酸、聚乳酸乙醇酸微球 224.2.3明胶微球 224.2.4壳聚糖微球 234.2.5聚羟基丁酸酯微球 234.2.6磁性微球 234.2.7生物黏附微球 234.3多肽蛋白类药物的长效注射微球突释控制技术研究进展 244.3.1长效微球的释药机制 244.3.2突释控制技术的研究进展 254.3.2.1药物的结构修饰 254.3.2.1.1制成前药 254.3.2.2聚合物性质 254.3.2.2.1聚合物组成比 254.3.2.2.2聚合物分子量 264.3.2.2.3聚合物联用 264.3.2.3添加剂的选用 264.3.2.3.1内水相添加剂 274.3.2.3.2油相添加剂 274.3.2.3.3外水相添加剂 274.3.2.4油相溶剂的选择 285.结语 28参考文献： 30致谢 31多肽材料在药物释放领域的研究进展xxxxxxxxx化学与环境保护工程学院化学工程与工艺摘要多肽类物质是一类非常重要的药物，目前已广泛地应用于临床诊断和治疗中。本文对多肽类药物研究开发新进展，多肽的合成方法，蛋白质及多肽类药物结构稳定性的研究进展，多肽及蛋白质类药物在药物释放领域的研究进展，多肽类药物应用发展前景作一综述。重点介绍了多肽及蛋白质类药物在药物释放领域研究进展中的多肽及蛋白质类药物智能释放系统的研究进展，缓释微球制剂的研究进展，多肽蛋白类药物的长效注射微球突释控制技术研究进展。关键字：多肽药物，研究进展，功能，药物释放领域，发展前景TheProgressofPeptideResearchinDrugReleaseAbstractPeptidesareakindofimportantdrug,whichhasbeenwidelyusedinclinicaldiagnosisandtreatment.Inthispaper,theprogressofpolypeptidedrugsresearch,thesynthesismethodsofpolypeptide,structurestabilityofpeptidedrugsindrugreleasearereviewed.Weintroducedtheresearchprogressofsustainedreleasemicrospheresandlong-actinginjectionmicrospheremutantpolypeptide.Keyword:peptidedrugs,researchprogress,function,thefieldofdrugrelease,developmentprospects前言多肽、蛋白质类药物具有活性高、疗效稳定、毒副作用小、用量少等优点，对癌症、自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血压和某些心血管及代谢等疾病有显著的疗效和广泛的应用前景，因此备受国内外专家的关注。自1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素以后，50年代的研究主要集中在脑垂体所分泌的各种多肽激素并取得了很大的进展。到60年代，研究的重点转移到一类典型的神经细胞所分泌的活性肽(神经肽)，即由下丘脑所形成的激素释放因子和释放激素抑制因子。70年代，脑啡肽及脑中其他阿片样肽的相继发现，使神经肽的研究又进入了高潮，在研究脑活性肽(脑肽)的同时，胃肠激素的研究也十分活跃，成为发展较快的一个研究领域。近年来，随着生物技术的不断发展，利用生物技术合成并研究了多种多肽类药物，已经成为了药物研究的热点问题。随着医疗科学的不断发展，多肽类药物已成为21世纪重要的诊断、监测、预防和治疗药。1.多肽类药物研究开发新进展1.1多肽类物质研究改革自神农尝百草，行医用药以来，人类一直致力于解决健康问题。一系列新的治疗手段和方法随科技进步而逐步进入人们的视野，这也给许多疑难病症的治疗带来了希望。目前，基于修复受损基因的基因治疗以及利用纳米载体对基因和药物进行传递释放已成为生物医学领域的研究热点。多肽是由20种天然氨基酸组成，具有特殊物理、化学性质，能调节体内系统和体细胞间生理功能，可快速被机体主动吸收并参与循环代谢的活性物质，已成为一类具有广阔应用前景的新型生物医用材料[1]。随着大量具有特殊生物活性多肽的分离及测序工作的完成，其作用机制得到了相应的研究，应用范围也从早期单纯利用聚多肽的生物可降解性，发展到利用多肽特殊的生理功能和生物活性等。现代科学研究结果表明：世界上的任何生物从最简单的病毒到高级蛋白质均由20种氨基酸所组成。由于氨基酸排列组合的形态不同，形成了自然界形形色色的蛋白质世界。按目前国际科学界的分类法，凡是小于100个氨基酸的蛋白质通常称之为“多肽”，而大于100个氨基酸分子的物质则称之为蛋白质。氨基酸分子小于10个的物质被称之为“寡肽”。从1902年英国科学家首先从动物胃肠道消化液里分离出“促胰腺分泌素”一种多肽类物质开始。在过去一个多世纪里多肽类研究已取得令人惊讶的长足进展。科学研究证实，实际上人类的各种内分泌激素基本上都属于多肽类物质从甲状腺素、垂体激素、胰岛素、神经肽、脑啡肽、生长因子到促性腺激素、黄体激素的等等。可以认为，多肽类物质是人体最重要的功能型调节剂，从胚胎发育到细胞生长、衰老等均离不开多肽。到90年代末，科学家已发现的天然多肽类生理物质已有数万种之多。它们涉及激素神经、细胞生长、生殖、肿瘤病变、神经激素传递质及免疫调节等等。尽管多肽的发现已有百年之久，但它作为药物的开发史只有短短20年。在这20年里，世界各国开发上市的多肽类药物至少有100多种，如目前国际市场上畅销的多肽类药物有亮丙瑞林、戈瑞林、布舍瑞林、促黄体激素拮抗剂、Fuzeon和利用生物工程手段生产的各种药物(如人生长激素、白间素、人胰岛素、干扰素和集落细胞生长因子等等)。据有关方面报道，2006年全球蛋白质多肽类药物总销售额已超过600亿美元大关。预期今年将达750800亿美元，年增长率达20％以上。故多肽类药物业已成为国际市场上一重要大类产品。国际科学界将多肽类物质分为两大类即1.内源性多肽(指人体固有的内生性多肽)与2.外源性多肽如人们熟知的蛇毒、蝎毒、蜂毒、蛙毒、水蛭素、竽螺毒素、唾液酸和苍蝇分泌的“杀菌肽”等等均为典型外源性多肽物质。其中不少外源性多肽早已被开发成为国际市场上的热销药品。目前无论内源性多肽或外源性多肽均为国际医药业界的热门开发品。几年前美国科学家从非洲爪蛙皮肤表面的粘液中分离出一种多肽类物质——麦盖宁(magain—in)，试验证明该物质对一切微生物有强大抑制作用。美国研究人员拟从改变麦盖宁的分子结构着手，以期开发出全新高效抗生素。美国Helix生物制药公司以蚕、蟹、牛等动物体内分离出的多肽类抗菌物质为“蓝本”进行结构修饰，现已据此开发出多只具有抗耐药菌株作用的新型抗生素，它们将在今后几年内投放市场。海洋生物也是一大多肽类药物的宝藏。科学家从太平洋海绵到海兔、海螺等海洋生物体内已分离出数以百计的全新结构的多肽类物质，其药理作用包括：降血压、增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒到抗寄生虫等等。据悉目前已进入临床前阶段的海洋生物多肽类新药约有一、二十种。其中以来自海兔的多肽和竽螺毒素衍生物(也是一种多肽)的上市前景十分光明。至于海绵类“抗癌多肽”的研究工作至今仍在进行中。1.2多肽药物的主要功能及重要性肽在生物体内作为载体和运输工具，将人们平常所食的营养物质输送到人体各个部位，充分发挥营养物质功能。肽在生物体内作为神经递质，传递信息。肽具有极强的活性和多样性，可全面调节人体生理功能，增强人体生理活性。肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且具有特殊的生物学功能，可防治血栓、高血脂、高血压，延缓衰老，抗疲劳，提高机体免疫力，促进人体对蛋白质、维生素、氨基酸等营养物质和钙、铁、锌、硒、镁、铜等多种有益的微量元素的吸收。有些小肽还具有原食品蛋白质或其组成氨基酸所没有的重要的生理功能。实验证明，许多多肽的渗透压处于蛋白质与同一组成氨基酸之间，多肽的分子量比蛋白质小，又比氨基酸的大。蛋白质分子量大结构级次多而复杂，人体不易吸收和利用，减弱了其活性和生理功能，而氨基酸分子量太小，单个独立，数量、功能有限。与之相比，多肽，特别是小肽、寡肽具有极强的活性和多样性。用某些多肽取代氨基酸，可降低产品的渗透压，减少氨基酸引发的腹胀、腹泻、恶心和呕吐等不适症的可能性。比如有些多肽可阻止人体对胆同醇的吸收，而氨基酸产品因配方、排列、混合不同，不仅不能阻止而且还促进人体对胆固醇的吸收。有些氨基酸产品特别是口服品，不能像多肽那样促进人体能量的代谢，燃烧脂肪，而且还将营养变为脂肪，储存在体内，形成肥胖，引发高血脂、高血压、动脉硬化和心脏病。1.3世界多肽类新药开发上市情况1.3.1多肽类疫苗研究大有希望目前对人类健康构成重大威胁的两大病毒性疾病即艾滋病与病毒性肝炎均已有厂商在进行疫苗研制工作。如1999年美国公布2种具有抗HIV-1病毒活性作用的多肽类疫苗。最近国外又传来消息，对人类危害极大的丙种肝炎亦已有疫苗(多肽类疫苗)上市。预期抗肝炎疫苗年销售额将超过10亿美元。在可以预期的将来，包括抗艾滋病疫苗和抗肝炎疫苗将成为国际医药市场上的畅销商品，其市场前景十分光明。1.3.2抗肿瘤多肽肿瘤现已成为目前仅次于心血管病的第二大杀手疾病。虽然医学界迄今尚未彻底搞清楚肿瘤的精确发病机理但有一点可以肯定。不同的肿瘤所产生的酶调控因子各不相同。实验室研究证实：选择一种名为“特异性寡肽”(分子量小于10个氨基酸的肽类)可以有效控制肿瘤生长或预防肿瘤的发生。顺着这一思路，西方研究人员已筛选出数十种抗肿瘤寡肽类物质，其中有几只业已上市(如抗乳腺癌的新药和抗晚期肺癌的新药等)。1.3.3抗菌活性多肽科学家早就发现，苍蝇之类昆虫虽然生活在极其肮脏的环境里却从不生病，其原因即在于它们能分泌一种名为“抑菌肽”的强力抗菌物质。在过去几十年里西方学者从包括苍蝇、蚕和一些两栖生物体内分离出上百种不同的抑菌肽类质，利用成熟的生物工程技术，今后将有多只具有高效抑菌作用的新颖抗菌素问世，从而将彻底解决目前令人头痛的细菌耐药性问题。1.3.4抗病毒多肽病毒感染后一般要经过吸附(宿主细胞)、穿入、脱壳、核酸复制、转录翻译、包装等多个阶段。阻止以上任意过程的进行均可防止病毒复制，而最有效的抗病毒药物是作用在病毒吸附及核酸复制2个阶段，因此筛选抗病毒药物主要考察药物的抗病毒吸附和复制能力。病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。因此可从肽库内筛选与宿主细胞受体结合的多肽或能与病毒蛋白酶等活性位点结合的多肽，用于抗病毒的治疗。1.3.5多肽导向药物传统的抗癌药物在肿瘤治疗过程中通过血液循环，化学药物在体内扩散后分布于身体各个脏器，不仅作用于肿瘤，还作用于健康的组织和器官，因此需要很大的剂量才能达到预期的治疗效果，并且药物的选择性差，在杀死病变细胞同时也攻击正常细胞，产生很大的毒副作用，而且不能通过乍物屏障，无法对特殊病灶部位进行有效治疗。长期以来人们受困于药物在体内分布的特异性不够以致增加药物的用量，提高药物的成本和引发副作用等问题。多肽导向核技术的出现解决了这一药物发展中的难题。利用这一方案可以提高原有药物的疗效，而且可以开发出新的药物。针对上述缺点，科学家早在20世纪70年代就开展了靶向药物的研究。很多毒素(如绿脓杆菌外毒素)、细胞因子(如白细胞介素系列)等均有较强的肿瘤细胞毒性，如果长期或大量使用时，它亦可以损伤正常细胞，给机体带来了很大的副作用，影响对肿瘤的治疗效果。利用特异性作用于肿瘤组织或器官的结合分子能解决这个问题，从而改善抗癌药物的传递系统，提高药物导向的特异性，实现治疗的针对性和安全性。1.3.6作用于心血管的多肽类药物这类产品开发上市历史最悠久。其中最著名的多肽抗血管病药物为“水蛭素”(抗血栓药)和蛇毒抗栓酶等等。无论蛇毒、蝎毒或僵蚕素等均为天然多肽类药物原料。事实上我国中医早已将上述动物药材人药。对于动物来源的多肽研究在国际科学界方兴未艾，可以肯定，今后将会有更多治疗心血管病的多肽类药物问世。正在研究开发中的动物多肽类药物包括：胎盘提取物多肽、金钱白花蛇多肽、地龙(蚯蚓)多肽、蛤蚧多肽、海马多肽、林蛙油提取物等等。研究表明这些动物多肽有望被开发成为新颖心血管疾病治疗药物。1.3.7植物多肽植物多肽也是多肽类药物的一大研究热门课题。如人参所含的“谷胱甘肽”类似物、天花粉多肽、松花粉多肽、杏仁多肽、大豆多肽、云芝多肽、灵芝多肽、及其它担子菌类子实体多肽等等均有令人感兴趣的药理作用。且植物多肽的开发要比动物多肽开发相对容易一些。因为植物来源广泛及可以人工栽培等等。据了解植物多肽类保健食品在国外已形成一全新产业。如最早开发植物多肽的日本其市场上有形形色色的植物多肽类产品如添加植物多肽的牛奶、饼干、儿童营养早餐、口服液等等。在美国和欧洲也有不少类似的植物多肽类保健产品。可用于食品的多肽至少有数十种，其中包括：大豆多肽、酪蛋白生产的CCP(促钙吸收肽)、睡眠肽(从动物脑组织分离出的抑制短链肽)、白蛋白多肽、丝肽(蚕丝水解后生成的短链肽)和人参多肽等等。中药是我国的“国粹”也是我国药物研究的强项之一。据悉我国研究人员已从中药紫苑中提取出一种寡肽物ersnjaa，它有很强镇咳作用，从中药蛤蚧中可提取出“肌肽”产品，中药僵蚕中可提取出能激活肾上腺皮质的多肽产品，其它中草药如薏苡仁、葶苈子、杏仁、天花粉、蒲黄、地龙、海马、紫河车、金钱白花蛇和全蝎等等均为优质多肽的提取原料。总之，植物多肽已发展成为一新兴保保健产品。日本和欧美学者均认为，植物多肽对人体非常安全，且用量较小(每天只需几克)价格便宜，适合长期服用。1.3.8诊断用多肽诊断用多肽是诊断试剂中发展最快的产品之一。诊断用多肽主要用作抗原。检测相应原生物的抗体。“多肽抗原”的特点是比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，且易于制备。国外已开发应用的多肽抗原包括：各种肝炎病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、梅毒螺旋体病毒、囊虫、锥虫、莱姆病等热带病原虫的抗原、类风湿性关节炎专用检测试纸和其它各种新兴多肽类检测试剂等等。近几年来诊断用多肽制剂市场增长率以21％的速度高速增长。有人估计它们在国际市场年销售额已达数十亿美元，且发展势头强劲。总之，医学诊断用多肽类试剂已成为国际诊断试剂市场的一重要组成部分，其发展前景十分广阔。2.多肽的合成方法20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20种氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，像Asn，Gln，Tyr等。2.1碳二亚胺法合成多肽目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代，按照其结构可以分为两种：碳二亚胺型，鎓盐（Uronium）。2.1.1碳二亚胺型主要包括：DCC，DIC，EDC，HCl等。采用DCC进行反应，由于反应中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用仍然相当广泛。EDC，HCl因为其水溶解性的特点，在多肽与蛋白的连接中使用比较多，而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点，就是如果单独使用，会有比较多的副反应，但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反应控制在很低的范围。其反应机理如下：图2-1-2碳二亚胺型反应机理图2.1.2鎓盐型 鎓盐型缩合试剂反应活性高，速度快，现在使用非常广泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PYBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱，如二异丙基乙胺（DIEA）：N-甲基吗啉(NMM)，该试剂加入后，才能活化氨基酸。其反应机理如下：图2-1-2鎓盐型反应机理图2.2液相多肽合成液相多肽合成现在仍然广泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，合成成本低的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，可以选择的反应条件更加丰富，象一些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反应效率低，以及副反应等原因，无法应用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。2.3固相多肽合成固相多肽合成现在使用的主要有两种策略：BOC和FMOC两种。BOC方法合成过程中，需要反复使用TFA脱BOC，而且在最后从树脂上切割下来需要使用HF，由于HF必须使用专门的仪器进行操作，而且切割过程中容易产生副反应，因此现在使用受到实验条件限制，使用也逐渐减少。FMOC方法反应条件温和，在一般的实验条件下就可以进行合成，因此，也得到了非常广泛的应用。2.4磷酸化多肽合成磷酸肽在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或长肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。2.5自然化学连接自然化学连接方法的优点是可以采用完全脱保护的多肽，因此不存在溶解性问题，其反应也是在缓冲水溶液中进行，由于其利用的是巯基和硫酯的特异性反应，再经过由S到N的转变完成肽键的合成。3.蛋白质及多肽类药物结构稳定性的研究进展蛋白质及多肽的生物技术药物，具有生理活性强、免疫原性低、疗效高等诸多优点，随着生物技术的不断发展，其在人类疾病治疗中的地位也日趋重要，目前已成为国际药学界研究的热点之一。但多肽类物质自身固有的特点，如口服利用率较低、酶降解性高以及半衰期极短等，使其作为药物开发应用受到诸多的局限。而导致多肽类药物不稳定的一个重要原因就是多肽特殊的分子结构，其中多肽主链氨基酸的降解和侧链氨基酸残基的结构变化是多肽结构不稳定的主要因，因此从多肽类药物本身的分子结构进行改造，是改变其理化性质和药代动力学性质的根本。3.1影响蛋白质和多肽药物稳定性的主要因素3.1.1蛋白酶因素的影响当药物进入系统时，由各种酶引起的代谢，尤其是多种形式的蛋白水解酶的作用，可导致药物降解为小分子肽或者氨基酸。这类酶广泛存在于胃、肠道、肝脏和肾脏等器官中，其分布具有细胞组织的特异性。3.1.2蛋白质物理或化学上的性质变化物理变化包括聚合、沉淀；化学变化包括氨基酸残基的修饰，主要有氧化作用、还原作用、脱酰胺反应、水解反应、β消除、二硫化物交换等几种反应，并且蛋白质在构建中的稳定性和免疫原性以及导致蛋白质化学结构错误变化的环境条件也被认为是影响蛋白质代谢稳定性的主要因素。3.1.3受体介导的清除较大的多肽常通过受体介导的方式来清除，有不少例子显示，受体介导的清除可能是一种主要的清除机制。例如胰岛素，若减少与受体的亲和力就会显著提高其血浆半衰期。受体介导清除的限速步骤是药物与细胞表面受体形成非共价物的过程。受体清除具有细胞特异性。3.1.4肾脏的过滤消除蛋白质与多肽药物极易被肾小球滤过，因而其在体内的消除主要是通过肾脏完成的。肾小球的滤过作用主要取决于药物分子大小(水化半径)和所带电荷。分子量小于20kD的细胞因子、激素等小分子蛋白肾小球滤过时几乎没有阻力。而且与小分子化学药物不同，蛋白药物一般不具有脂溶性。因而不能被肾小管重吸收，只能以原药形式或被肾小管中的蛋白酶D降解后以降解产物形式从尿中排出。这不仅明显缩短了药物的半衰期，而且会产生剂量相关的肾毒性。3.2蛋白质和多肽药物获得稳定性的研究方法3.2.1化学修饰化学修饰不仅是多肽类药物定向改造、提高稳定性的有力工具，也是研究多肽结构与功能的一种重要手段。对多肽的主链基团和侧链基团都可以进行化学修饰。主链基团修饰包括氨基酸肽链的延长、切除及氨基酸定位突变等；侧链基团修饰主要集中于氨基、巯基和羧基上。修饰剂主要有葡聚糖、多聚唾液酸、聚乙二醇、四硝基乙烷等。根据修饰剂与多肽之间反应的性质，修饰反应可分为糖基化反应、酯化反应、酰化反应、取代反应、磷酸化反应、烷基化反应、氧化还原反应等。由于烷基化反应和氧化还原反应对多肽的活性影响较大，实际应用较少，而磷酸化反应对多肽稳定性的影响意义不大。现主要对前4种修饰反应进行重点介绍3.2.1.1糖基化反应糖基化是指多肽的氨基和单糖还原端的羰基在温和的条件下经过一系列变化成为较稳定的糖肽的过程，是一种较为理想的稳定多肽类药物的方式，糖链的存在及其结构的可变性、复杂性和多样性直接影响着糖肽在组织中的降解和在体内的寿命，也使得糖肽成为药学研究的新热点。脑内的亮氨酸脑啡肽可特异性地与阿片受体结合，在机体内起着调控痛觉感受并调节心血管与胃肠功能的作用，但半衰期短。Roscic等用葡萄糖对亮氨酸脑啡肽进行修饰后，其稳定性显著增强，而且二者形成的咪唑啉酮复合物可有效阻止血浆中酶的降解。3.2.1.2酯化反应酯化是指多肽的羧基和醇羟基形成较稳定的酯类化合物的反应。聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG是常用的酯化反应试剂，是一种线性、亲水、灵活而不带电的高分子聚合物。通常选择相对分子质量大于10000的PEG在温和的条件下对多肽进行修饰，选择合适的修饰类型、修饰程度以及修饰位点有利于改善多肽类药物的活性并提高其稳定性。目前已有不少经PEG修饰的多肽类药物如PEG-IL-2[2]、PEG-水蛭素等已进入临床试验阶段。2006年，Pan等用PEG修饰胰高血糖素样肽GLP-1的C端后，GLP-1的活性和稳定性都得到了较的提高。3.2.1.3酰化反应酰化是指在多肽分子上导入酰基使之成为酰化肽的过程。酰化试剂多为氨甲酸、乙酸酐、酰氯等物质，经酰化反应修饰的多肽稳定性通常都有较大提高。Ligeti等在痛敏肽（nociceptin）的N端用氨甲酸修饰后，其活性和稳定性均有明显提高。Zobel等把系列磷酸酯连接在与抗凝血肽相结合的白蛋白上，经耳缘静脉注射于家兔体内，结果显示抗凝血肽的半衰期延长了近50倍，但实验也表明，酰化肽常存在生物利用度不高等问题而影响其在多肽类药物中的推广使用。3.2.1.4取代反应天然多肽由L-氨基酸组成，稳定性较差。据此可以选择结构类似而对酶不敏感的氨基酸如D-氨基酸、羟基氨基酸、甲基化氨基酸、杂环氨基酸或烷基等取代相应的L-氨基酸，通常既能减少对活性中心的影响，又能有效提高多肽类药物的稳定性。Chen等比较了D-型与L-型的α螺旋抗菌肽V，发现二者抗菌活性一致，但D-型对胰蛋白酶不敏感，稳定性较好。Boeglin等在研究黑皮质激素受体拮抗剂中的一段序列Ac-His-D-Phe-Arg-Trp时，发现以氮杂环氨基酸取代C端Trp能有效抑制酶的降解，提高代谢稳定性。而DUrsi等在合成一种拮抗猫免疫缺陷病毒的八肽Ac-Trp-Gln-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile时，发现肽Trp-rich基序用适当长度的简单烷基替换后，其抑制活性和稳定性都有较大的提高。3.2.2延长肽链延长肽链也称分子末端修饰。稳定小分子线性肽链结构的驱动力主要来自主链与主链间及侧链与侧链间的静电作用，所以在一定肽链范围内从N端或C端延长肽链，可加强静电作用进而提高多肽的稳定性。例如，在酵母蛋白酶传染性因子（Sup-35）中的七肽片段Gly-Asn-Asn-Gln-Gln-Asn-Tyr的N端，逐级连接二肽或三肽片段，随着肽链的延长，所形成的寡聚物的稳定性也不断增强[3]。在神经六脉Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys的N端和C端分别连接D-Phe和Thr后，其活性和稳定性较天然六肽均明显增强。沿肽链骨架延长对酶不敏感或对热较稳定的氨基酸序列，从而抑制氨肽酶和羧肽酶从N端或C端的降解，对多肽类药物和酶类药物稳定性的研究都有非常重要的意义。3.2.3形成环肽环肽是相对于直线肽链而言的，具有生物活性的环肽通常具有明确的限制性构象，能够与受体很好地契合。由于分子内没有游离的N端和C端，环肽对于氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低。与直线肽链相比，环肽在抗真菌和杀灭肿瘤细胞等方面都表现出天然的优势。将直线肽链形成环肽，或者在具活性的直线肽链上连接一个环肽单元，往往可使多肽的活性和稳定性都得到明显提高。如细胞黏附肽Arg-Gly-Asp用于器官手术时，在促进增生方面作用显著，但易降解及缺乏选择性，通过在该肽链上连接双基乙二醇（diazaethyleneglycol）衍生物形成环状结构后，不但能同样抑制结合纤维蛋白原和纤维结合蛋白的能力，而且稳定性也有所提高。Arg-Gly-Asp-Val-Tyr能抑制人白血病细胞K562与纤维结合蛋白的黏连，Siemion等在该肽链的两端借助Cys连接形成含二硫键的环七肽后，其抑制活性明显增强。根据环合方式，环肽可分为首尾相连环肽、侧链与侧链相连环肽、侧链与端基相连环肽、含二硫桥的环肽以及其他桥连结构的环肽。环合产物构象的改变，可使其活性发生较大改变。如胸腺五肽变为环状七肽后，活性明显降低。吗啡肽的环状类似物H-Tyr-c[D-Cys-Phe-Cys]NH2与H-Tyr-c[D-Cys-Phe-D-Cys]NH2分别是阿片受体μ和δ的拮抗剂，用二甲基（-CH2-CH2-）或顺二亚甲基（-CH=CH-）替代二硫键形成环肽后，其类吗啡肽的活性明显减弱。Tamilarasu等通过计算机模拟构象发现，肽链在环合前后构象变化越小，对直线肽链的生物活性保持就越有利，而应用侧链成环对肽链的构象影响最小，据此他运用正交保护法合成了六元环肽，取得了理想的效果。总之，环肽独特的结构使之在多肽类药物结构稳定性的研究中备受关注，有广阔的开发和应用前景。3.2.4微囊包埋用微囊包埋蛋白质和多肽药物，不仅可以通过缓释作用实现长效皮下注射制剂，而且可以通过微囊表面和粒径的设计，实现口服、黏膜给药、吸入等新剂型。微囊型的皮下注射制剂必须解决包埋和释药过程中的蛋白质活性保持问题。口服制剂必须克服蛋白质在胃肠内被分解、生物大分子难以被消化道吸收的困难，而包埋蛋白质药物的微囊化技术是解决困难的惟一方法。目前微囊的主要成分为壳聚糖，该物质已被广泛研究用作蛋白、非病毒基因载体。壳聚糖是一类由2-氨基-2-脱氧葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的带正电荷直链多糖，壳聚糖基纳米粒子比微米粒子具有更多的优越性，可使大分子顺利通过上皮组织，促进药物的渗透吸收，延长药物在体内的循环时间，有效地提高药物的利用度，减少副作用。用微囊包埋蛋白质和多肽药物，可以减短给药的周期，蛋白质和多肽药物的修饰技术能将1天1次的注射最长可延长到2周1次，微囊化技术可实现3个月1次的注射，甚至更长的周期。另一方面，微囊化技术还将给预防医疗带来新的途径，例如以往的注射疫苗用微囊包埋后，可以实现口服和鼻腔黏膜给药，使人体在各黏膜处产生免疫。由于很多病毒都是从黏膜处感染人体的，口服和黏膜给药可将外来病毒阻挡在黏膜外，比注射疫苗起到更好的效果。4.多肽及蛋白质类药物在药物释放领域的研究进展4.1多肽及蛋白质类药物智能释放系统的研究随着蛋白组学计划的逐步深入，蛋白质结构与功能的关系逐渐被破解。近年来越来越多的多肽及蛋白类药物在诊断、治疗或作为疫苗预防各种疾病方面发挥着重要作用。与小分子药物相比，多肽及蛋白类大分子药物具有稳定性差、易被酶降解、生物半衰期短、扩散差、分配系数小、难以通过生物屏障及脂质膜等特点而限制了其应用。所以，如何将这些生物物质有效地送达人体相应病灶部位，是目前多肽及蛋白质研究的重要方向。高分子药物智能控释系统是指以智能高分子材料作为药物释放的载体，具有传感、处理及执行的功能，对外界刺激可感知，并根据自反馈作出响应，控制药物脉冲释放，从而达到药物控释智能化的目的[4]。高分子水凝胶是由具有三维交联网络结构的高聚物和作为溶胀剂的水组成的，水凝胶具有随周围环境而变化的功能。凝胶体积通过感知温度、pH、盐浓度、光强度、压力变化并实现环境回应的分别称温敏、酸敏、盐敏、光敏、压敏水凝胶。此外还有生化回应水凝胶、形状记忆水凝胶、电场回应水凝胶、红外激光回应水凝胶[5]。高分子水凝胶的这些特性对药物的智能控制释放有重要意义。由于多肽及蛋白质类生物大分子药物的特点，因而不宜采用直接口服、皮下注射和滴注等一般给药途径，而求助于高分子水凝胶与生物大分子的智能控释系统。即高分子水凝胶通过对体内微环境的变化作出理性响应以控制药物的释放。4.1.1单一响应性智能释放系统4.1.1.1温敏性智能释放系统温敏性高分子水凝胶通常由N一取代的丙烯酰胺(AAm)和甲基丙烯酰胺(MAAm)或相类似的单体合成。温敏性高聚物凝胶能响应温度变化而发生体积溶胀或收缩，是因为这类凝胶大分子链的构象能响应温度刺激而变化。低温时凝胶因氢键及水合在水中溶胀；当升至一定温度时，因氢键被破坏，凝胶发生急剧的脱水作用。疏水性基团相互吸引使大分子链收缩而呈现出体积不连续变化的突变现象称之为高分子凝胶的体积相转变。体积不连续变化时的温度称为相变温度，称为高分子水凝胶的低临界溶液温度。将此种高分子聚合物作为药物释放的载体材料，则可对环境温度的改变作出应答，从而可进行药物的智能控制释放。Hsiue等研究了热敏性聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)作为抗青光眼药物的载体材料，用于青光眼病治疗的智能控释系统。他们既用了线形的PNIPAAm水溶液，又用了线形的PNIPAAm和交联的PNIPAAm纳米颗粒的混合物作为载体。发现当温度从室温升到32℃时，清亮的PNIPAAm溶液发生了相转变而出现浑浊，PNIPAAm水溶液的相转变温度即为32C。在室温时，药物被夹入缠结的聚合物链中或被封闭在交联的聚合物凝胶内，在较高温度下局部施用后缓慢释放。他们还制备出了包含有肾上腺素的线形PNIPAAm和交联的PNIPAAm纳米颗粒，测定了体外的药物释放速率和细胞毒性，此两种载体材料都无细胞毒性。由线形PNIPAAm或线形PNIPAAm和交联的PNIPAAm纳米颗粒的混合物制备的制剂被用于兔子实验，发现具有眼内降压的作用。这种线形PNIPAAm制剂的降压应答持续时间比传统的滴眼药水要长六倍(持续24h)。而对于线形PNIPAAm和交联PNIPAAm纳米颗粒的混合物制剂，此低压效应持续时间可长八倍(持续32h)。这些结果说明，使用热敏聚合物溶液或热敏聚合物凝胶，对于抗青光眼药的控制释放的临床应用具有很大的潜力。Chu[6]等研究了热敏性PNIPAAm及其共聚物，作为核一壳微胶囊膜孔的热敏性开关。将PNIPAAm或PNIPAAm和苯并-18-冠-6-丙烯酰胺(BCAm)接枝于微胶囊的膜孔内，由环境温度的高低(高于LCST或低于LCST)来控制微胶囊内药物的释放。4.1.1.2酸敏性智能控释系统这类水凝胶的溶胀或去溶胀是随pH值的变化而发生变化的。一般来说，具有pH响应性的水凝胶都是通过交联而形成大分子网络，网络中含有酸性(碱性)基团，随着介质pH值、离子强度的改变，这些基团发生电离，导致网络内大分子链段间氢键的解离，引起不连续的溶胀体积变化。高分子水凝胶作为药物载体时，由于被包裹药物的扩散受水凝胶溶胀所控制，当外界环境的pH值发生变化时，药物扩散受外界的刺激作出相应的变化。pH敏感水凝胶药物释放系统特别适合于口服给药，即利用胃肠道pH值的差异，控制药物在特定部位释放。为防止多肽及蛋白质药物在胃中失去活性，将药物包裹在有弱酸性基团的聚合物水凝胶中，在胃中的酸性条件下，水凝胶形成氢键处于收缩状态，封闭在水凝胶内的多肽、蛋白类药物扩散不出，而不能与胃酸接触，到达肠道后，环境由酸性变为弱碱性，氢键破裂，水凝胶吸水溶胀，药物就通过溶胀扩散而释放出来。pH敏感水凝胶还能保护药物不被破坏，并可使药物控制释放。在聚N，N-二甲基丙烯酸羟乙酯与岩藻糖胺中加入偶氮芳香交联剂，制备含有5-氨基水杨酸的pH敏感凝胶，避免了药物在胃及小肠中受到破坏。当共聚物被结肠细菌降解后，5-氨基水杨酸才被释放出来。4.1.1.3电场敏感性智能控释系统1982年，Tanaka发现部分水解的聚丙烯酰胺凝胶浸入水-丙酮溶液中，在接触电场下，凝胶呈现非连续的体积变化，当撤除电场后，凝胶可恢复至初始状态，从而促进了电场驱动的高分子凝胶的研究进展。电场驱动的药物释放体系可根据电场的开关，自动地控制药物释放的通断。载胰岛素的PMMA凝胶对胰岛素的释放受电场开关的控制，具有通断特性，这种凝胶可作为一种不带活动部件的可植入的胰岛素泵的基础。Won合成了2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与甲基丙烯酸正丁酯共聚物凝胶，包载带正电荷的依酚氯铵。当外加电场后，带正电荷的溶质与阳极水解产生的水合离子交换释药，实现完全的开关控制作用。用聚乙烯唑啉与聚甲基丙烯酸制成胰岛素的骨架型给药系统，在生理盐水中通电后，近阴极处溶液pH值增加，骨架向阴极处释放胰岛素，其释放速度近于恒定。4.1.2双重响应性智能释放系统4.1.2.1温度、pH值敏感性智能释放系统此类高分子水凝胶是由pH敏感性聚合物和温敏性聚合物通过接枝聚合、嵌段共聚或用互穿网络而合成的，都具有温度、pH值双重敏感性。其中各聚合物链段都具有各自不同的刺激响应性。刘锋等[7]合成的含不同羧基量的两个系列的pH敏感及温度敏感水凝胶聚(N-异丙基丙烯酰胺-CO-丙烯酸)(NA)及含聚二甲基硅氧烷的聚(N-异丙基丙烯酰胺-CO-丙烯酸)(NSA)在37℃和pH-1.4条件下(胃的pH)不溶胀，处于收缩状态，从而抑制其体系内分子向外扩散；而在37℃和PH-7.4条件下(肠的pH)处于溶胀状态，使体系内的分子可以自由向外扩散。因此，在酸性条件下起到保护蛋白质分子的作用；而在碱性条件下，又可以将蛋白质分子释放出来，以达到治疗的目的。复配消化药木瓜蛋白酶在4℃、PH-7.4条件下最稳定，而在37℃或4℃、PH-1.4条件下木瓜酶都不稳定，在37℃、PH-7.4时木瓜酶慢慢失活。将木瓜酶吸附在水凝胶中，并置于酸性介质中，再进行干燥处理后，则由于氢键等作用及聚二甲基硅氧烷的疏水功能，可起到保护酶的作用；在37℃、PH-7.4的磷酸盐缓冲液中，两种水凝胶开始释放酶时，都有个快速释放的过程，随后逐渐放慢，使吸附在水凝胶中的木瓜酶随生物体内环境变化自行完成药物的控制释放。4.1.2.2光、热敏感性智能释放系统以含少量无色三苯基甲烷氢氧化物或无色氰化物与无色二(N，N-二甲基酰替苯胺)-4-乙烯基苯基甲烷衍生物、丙烯酰胺和N，N-亚甲基-双丙烯酰胺共聚可得光热刺激响应聚合物凝胶。其相变机理有两种：一是利用紫外线的离子化，如以热响应性异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)和光敏性分子合成凝胶，它可藉紫外线而电离，引起凝胶溶胀，在32℃凝胶体积相转变，紫外线遮蔽时凝胶可逆地不连续收缩回复；另一种机理为光吸收时局部高分子温度上升，用PIPAAm和叶绿酸的网络组成凝胶，它可响应可见光产生相转变，此时因光照引起高分子温度上升，呈现凝胶体积收缩的相转变，而未光照时凝胶体积在32℃时随温度连续变化。对含有无色三苯基甲烷氰基的聚N异丙基丙烯酰胺凝胶的平衡溶胀体积变化的温度依赖性，表明在无紫外线辐照时，30.0ＯC产生连续的体积变化；紫外光辐照时无色氰基产生光离解，凝胶产生不连续体积转变，温度由25℃逐渐升高，在32.6ＯC凝胶体积突变减少90%。在此转变温度以上，凝胶也在31.5℃发生不连续溶胀达10倍。如果将温度固定于32℃，凝胶在紫外线辐照与去除辐照时可起不连续的溶胀一收缩开关功能。根据此共聚物凝胶的智能性，就可以设计成智能控释系统用于多肽、蛋白类等药物的控制释放。4.1.2.3pH值、阳离子敏感性智能释放系统李文俊等[8]以天然高分子甲壳素的脱乙酰基产物壳聚糖(CS)以及聚丙烯酸(PAA)为原料，制成了一种新型的以壳聚糖和聚丙烯酸之间所形成的聚电解质配合物为基础的Semi-IPN水凝胶膜，Semi-IPN电交联组分为CS，它不仅对pH的变化非常敏感，对离子也显示出特殊的刺激响应性。CS.PAASemi-IPN水凝胶膜在强酸条件(pH<2)下强烈溶胀，随着pH值的上升，溶胀度迅速下降，在一个很宽的pH值区域(3<pH<8)内，溶胀度都小于100，当pH>8时，溶胀度又重新开始上升，在pH=11附近，溶胀度达到最大值，继续增加pH值，由于渗透压的关系，溶胀度又开始下降。Semi-IPN之所以在酸碱条件下都发生溶胀，是由于酸碱可以破坏其中的静电作用。考察Semi-IPN在各种盐溶液中的溶胀度(SW)，发现在相同金属离子价态和离子强度条件下，SW基本处于同一水平，在一定离子强度条件(I-115mol/L)下，SW在一价、二价和三价盐溶液中的SW呈跳跃式增加，CS.PAASemi-IPN配合物的这种特殊离子响应性相反于一般的离子交换树脂和单链聚电解质胶，它对pH和离子的敏感性及受环境刺激发生可逆溶胀和收缩的功能为其在多肽、蛋白类药物的控释和分离等方面的应用提供了可能。4.2缓释微球制剂的研究进展微球是近年来发展的新剂型，它是以清蛋白、明胶、聚乳酸等材料制成的球状载体给药系统，微球中的药物分散或包埋在材料中而形成球状实体，微球直径大小一般是0.3～100μm。不同粒径范围的微球针对性地作用于不同的靶组织。这类剂型的开发，对于发展缓释与靶向给药系统,有重要的意义。4.2.1清蛋白微球清蛋白微球制剂是人或动物血清清蛋白与药物一起制成的一种球状剂。清蛋白是体内的生物降解物质，注入肌体后，在肌体的作用下逐渐降解后清除，性能稳定、无毒、无抗原性,因此清蛋白微球制剂是理想的控缓释靶向制剂之一。4.2.2聚乳酸、聚乳酸乙醇酸微球聚乳酸(PLA)是一种无毒可生物降解的聚合物，具有很好的生物相容性。PLA和聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)微球是近年来国内外研究的热点。目前，大部分PLA和PLGA微球均采用乳化分散法和相分离凝聚法制备。其中相分离法适合于水溶性药物微球的制备，乳化分散法对水溶性、脂溶性药物均适宜。4.2.3明胶微球明胶作载体材料，无不良反应，无免疫原性，具生物可降解性，是目前动脉栓塞的主要材料，应用广泛，也可口服或注射。丁红等用乳化化学交联法制备阿霉素明胶微球，对其粒径及分布、体外释放药物进行了研究，并在此基础上进行了动物栓塞效果的初步实验。实验制备了阿霉素明胶微球，进行动物胃左动脉栓塞，其显示出来的特点一是末梢动脉栓塞作用强，不易产生侧支循环；二是提高了对肿瘤细胞的杀死指数。4.2.4壳聚糖微球壳聚糖无毒，具有很好的生物相容性、生物可降解性，作为一种新型药用辅料在缓释给药系统的应用引起了人们的浓厚兴趣。壳聚糖曾被提出制成微球，包封小分子抗炎药物，近年来壳聚糖已运载生物大分子活性物质。壳聚糖微球的制备有乳化交联、蒸发溶剂、喷雾干燥、液中干燥等方法。张珠[9]用加热固化法制备利福平壳聚糖蛋白微球，实验发现壳聚糖和人血清蛋白对药物具有缓释作用，药物含量不同亦导致体外释药速度不同，药物含量越高或者越低，其体外释药速度越快，而药物含量适中，则体外释药速度越慢。体外实验表明，利福平壳聚糖蛋白微球有明显杀菌作用，且可控制药物释放。4.2.5聚羟基丁酸酯微球聚羟基丁酸酯(PHB)为微生物合成的新型可降解材料，生物相容性好，具有中长期降解周期。其化学结构式为：[-CH(CH)3-CH2-CO-O-]n，它比PLA、PLGA降解周期长，生物相容性更好，较适合作为中长期控释药物的载体。与目前已有的其他可生物降解材料相比，有易纯化、无残留催化剂等优点[10]。王正容等用液中干燥法制备左炔诺孕酮聚羟基丁酸酯微球，通过小鼠抗生育实验证明，本制剂组与同剂量的原药组相比，延长抗生育效果更显著，不良反应小，安全性高。4.2.6磁性微球目前，磁性微球作为一种新型的生物分离技术和靶向药物的载体，受到人们的广泛关注和研究。磁性微球根据其组成材料的不同可分为磁性高分子微球、磁性生物大分子微球和磁性无机物微球。磁性微球给药载体的特点是减少用药剂量，增强药物对靶组织的特异性，提高疗效，减少不良反应。4.2.7生物黏附微球生物黏附微球是指药物与黏附材料分散在载体中，或与黏附材料包被含药微球而制成。这类微球在到达黏膜表面时，其中的黏附材料可与生物黏膜产生黏附作用，从而在黏膜表面滞留较长时间，并持续释放药物。其材料有脱乙酰壳多糖、羧丙基纤维素、卡波泊、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、聚卡波非、聚羧乙烯等。其制备方法有喷雾干燥法、溶媒干燥法等。在临床应用上可鼻腔给药、胃肠道给药、眼部给药、口腔、阴道等部位给药[11]。目前，生物黏附微球仍处于研究阶段。据部分研究数据表明生物黏附微球能够延长药物在给药部位的释放时间，控制药物的释放部位，提高难溶性药物、胃肠道吸收部位狭窄的药物的生物利用度，应用前景广泛。4.3多肽蛋白类药物的长效注射微球突释控制技术研究进展长效注射微球已成为多肽蛋白类药物新型给药技术研究的热点之一。采用可生物降解聚合物[如聚乳酸(PLA)，乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等]包裹药物制成注射用微球制剂给药后，药物随聚合物的降解缓慢释放，可达到长效目的。该制剂可在几周或几个月内以一定速率释药，维持有效血药浓度、减少给药次数、增强疗效及提高患者依从性。并且由于骨架材料可生物降解，减轻了局部刺激与不适。近年来，国内外针对多肽蛋白类药物的长效注射微球开展了大量研究，并取得了显著进展，国外已有注射用亮丙瑞林、奥曲肽等缓释微球上市。但部分制品受突释效应和药物稳定性的限制，仍处于实验室研究水平。突释效应对长效制剂而言，一般指第一天前后迅速大量释放药物的现象，可用24h累积释药率表示。国内外研究表明，多肽蛋白类药物的突释效应多在20％～30％，有时可能更高。短时间内释放大量药物一方面可能导致体内血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显不良反应；另一方面也可能影响后期释药水平而降低治疗效果。因此，突释效应已成为多肽蛋白类药物长效注射微球推广应用的限制性因素之一。4.3.1长效微球的释药机制亲水性药物从聚合物微球中连续释放，主要取决于聚合物的降解和药物的扩散。根据聚合物的降解规律和机制，骨架微球中药物的释放可分为3个阶段：①突释期，微球表面或近表面的部分药物迅速释放；②缓慢释放期，药物通过扩散或缓慢迁移的方式，由聚合物骨架溶蚀形成多孔结构缓慢释放；③快速释放期，随聚合物的不断降解，骨架结构破坏，药物出现第二次大量释放。微球表面或近表面存在的药量越大，药物的水溶性越好，微球内部越易形成孔道，或孔道对水的摄取能力越强，微球的突释量就越高。微球表面或近表面的药量，微球内部的孔道与所用的载体材料性质、处方组成﹑工艺参数﹑微球粒径及载药量等因素有关。4.3.2突释控制技术的研究进展为降低多肽蛋白类药物长效注射微球的突释效应，国内外学者开展了深入系统的研究与探讨。主要途径包括：①通过结构修饰改善药物性质，控制药物的迁移，降低微球表面或近表面的药量；②选择合适的载体材料、加入添加剂、改进制备工艺或控制微球粒径及载药量，使微球表面性质及微球结构发生变化，减少微球表面或内部孔道的形成，阻缓药物向微球表面或近表面迁移。4.3.2.1药物的结构修饰4.3.2.1.1制成前药多肽蛋白类药物的亲水性较强，因此突释效应较严重。采用化学手段进行结构修饰，制成亲水性较弱的前药，可减少因水溶性较大引起的突释。Seki等以水溶性好的5-氟尿嘧啶-2-脱氧核苷(FUDR为模型药物，采用L-PLA为载体材料制备了载药量为0.45％的微球，结果显示0.5h累积释放率高达50％。如在FUDR的3'、5'位羟基上引入脂肪酰基制成前药，再同法制成微球(以FUDR计，载药量分别为0.4％、2.1％、4.1％和5.2％)，24h累积释放率依次为1％、5％、20％和30％（以FUDR计）。由此表明，经结构修饰后，药物的水溶性降低，制得的微球不仅载药量提高，同时突释量明显下降。4.3.2.2聚合物性质4.3.2.2.1聚合物组成比PLGA由乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)两种单体按一定比例聚合而成，两种单体间的共聚比例会影响微球骨架亲水性。在一定范围内随GA比例上升，PLGA亲水性增强，对水分的摄取力提高，微球中药物突释量增大；反之，药物突释量降低。O'Hagan等制备了卵清蛋白PLGA微球，考察相同分子量、不同单体组成的PLGA对药物突释的影响。结果表明，聚合物中GA比例由50∶50降至75∶25，微球中卵清蛋白的突释量由40％减少至20％。4.3.2.2.2聚合物分子量微球表面的孔隙率和内部的致密度与突释效应直接相关，而这两者又与聚合物分子量直接相关。分子量高的聚合物溶液黏度大，形成的微球骨架密度大，孔隙率低，突释小。Raman等[12]制备了吡罗昔康PLGA微球，控制微球粒径(10um)和载药量(20％)水平，考察PLGA分子量(或黏度)对微球体外释放的影响。结果表明，5种分子量的PLGA(内在黏度分别为0.17、0.39、0.59、0.82和1.08dl/g)制得的微球突释量分别为78％、20％、14％、12％和5％，可见微球突释随聚合物载体分子量的增大而降低。也有人提出“迁移”理论解释这一结果，即乳化时乳滴中分布有大量的药物液滴，搅拌挥发有机溶剂时乳滴绕搅拌浆做圆周运动，在离心力作用下乳滴中的药物液滴向乳滴表面迁移，因此部分药物分布在微球近表面；若采用分子量较高的聚合物载体，由于其黏度高，溶剂挥发过程中，高分子量材料很快沉淀固化，可阻止药物的迁移，减少微球突释。此外，聚合物分子量也影响水分渗入骨架的速率。聚合物分子量大，疏水性强，水分不易渗入聚合物骨架，突释量减少。O'Hagan等以单体组成比相同(50:50)、分子量不同(33000、58000和84000)的PLGA为载体材料，制备卵清蛋白微球，测定结果显示，突释量分别约为90％、40％和20％。4.3.2.2.3聚合物联用将PLGA和PLA等多种聚合物材料以适当的比例混合，利用药物与聚合物亲和力的差异，控制药物在微球中的分布，可起到降低微球突释量的作用。Matsumoto等以按不同比例混合的PLGA和PLA为骨架材料，制备了顺铂微球。溶解在二氯甲烷中的PLGA与PLA浓度超过一定值时，PLGA与PLA由于不相容而出现相分离，亲水性的顺铂与PLGA的亲和力较大，因此主要分布于PLGA层。当PLA比例大于PLGA时，微球表面被无药层覆盖，药物分布于微球内部，突释量仅为10％；当PLGA比例大于PLA时，微球表面被含药层覆盖，药物分布于微球表面或近表面，突释量为25％。4.3.2.3添加剂的选用采用复乳-溶剂挥发法制备多肽蛋白类药物微球时，在内、外水相或油相中加入合适的添加剂，可有效控制微球突释水平。4.3.2.3.1内水相添加剂吐温-20：多肽蛋白类药物可表现出较弱的两亲性，可迁移聚集至油水界面，固化成球后就吸附在微球表面或近表面。若在内水相加入乳化剂吐温-20，可与药物竞争聚集在油水界面，减少药物的聚集，从而降低微球突释量。葡萄糖：一般认为PLGA的降解由4个过程组成，即水合作用、初步降解、进一步降解和溶解。在水合作用阶段，水性介质渗入聚合物基质中，导致聚合物分子链松弛和玻璃化转变温度降低。在内水相加入葡萄糖，能加快微球表面松弛PLGA链段的重排，减弱PLGA的水合作用，从而降低突释。Wang等在奥曲肽PLGA微球中加入少量葡萄糖，突释率由不加葡萄糖的(30±20)％降至(8±3)％。4.3.2.3.2油相添加剂L-精氨酸：L-精氨酸与某些药物和PLGA之间可能存在离子对作用，可增大PLGA黏度，降低微球突释。Takada等制备了抗血小板药GPⅡb/Ⅲa拮抗剂(TAK-029)的PLGA微球。研究表明，L-精氨酸在含PLGA二氯甲烷中的溶解度较大，原因可能与L-精氨酸-PLGA的离子对作用有关。该作用可使PLGA溶液黏度增大5.2倍，在L-精氨酸-PLGA溶液中加入无定形TAK-029，PLGA溶液黏度增大44倍。体外试验表明，油相加2.0％与不加L-精氨酸制得的微球包封率分别为89％和91％，突释率分别为20％和12％。疏水性阻滞剂：疏水性阻滞剂可堵塞聚合物载体吸水膨胀后产生的孔道，减慢水化速度，阻止药物扩散。Lam等[13]用喷雾冷冻干燥法制备了神经生长因子-PLGA微球，在载体中分别加入3％和6％的碳酸锌，可将突释率从15％降低至1.5％和1％。甘油：加入甘油可使PLGA的玻璃化转变温度降至36.7℃，在37℃的体内环境下，微球表面的孔洞会迅速消失，减少突释量。Yamaguchi等采用溶剂挥发法制备了胰岛素-PLGA注射微球。试验表明，在油相中加入一定量的甘油，微球的突释由不加甘油时的57.6％降至9.6%.4.3.2.3.3外水相添加剂复乳中的油相相当于一层半透膜，内水相和外水相是半透膜两侧的溶液，当两侧溶液存在渗透压差时，水分由低渗透压通过半透膜向高渗透压方向迁移。由于内水相含有药物，渗透压高于外水相，水分从外水相迁移至内水相，使内水相液滴变大。冷冻干燥时易在微球内部和表面留下大量孔道，使微球结构变得疏松，突释现象明显。在外水相加入增加渗透压物质后，内外相渗透压差减小，从外水相迁移至内水相的水分减少，冷冻干燥过程中形成的孔道少，微球表面光滑，内部结构致密，药物不易快速释放，突释量降低。Pistel等制备了牛血清白蛋白(BSA)-PLA微球，考察在外水相加入氯化钠对突释的影响。结果表明，与不加氯化钠的处方相比，微球6h累积释放率由30％降至10％以下。4.3.2.4油相溶剂的选择有机溶剂挥发固化成微球过程中，聚合物随溶剂的挥发形成凝胶。由于聚合物材料在乙酸乙酯中的溶解度较低，因此以乙酸乙酯代替常用的二氯甲烷作溶剂时，触发聚合物凝胶形成所需的溶剂量较少，形成外壳的时间也就较早；同时由于乙酸乙酯的沸点(70℃)高于二氯甲烷(约40℃)，形成外壳后溶剂挥除缓慢，有利于微球表面无孔结构的形成，降低突释量。Wang等[14]用喷雾干燥法制备依他硝唑-PLGA微球，考察有机溶剂对微球突释的影响。结果表明，采用二氯甲烷制备的微球0.5h累积释放率为47％，24h则为95％，而采用乙酸乙酯制备的微球则分别为21％和85％。5.结