氨基酸营养缺陷型-2课件

氨基酸营养缺陷型的筛选与鉴定

第二组：刘俊汝和稚力谷中如实验目的

1、学习营养缺陷型突变菌株选育的原理2、掌握营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法3、了解芽孢杆菌变异菌株的检出方法实验原理

营养缺陷型（auxotroph）：指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异菌株常用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记

实验原理

基本培养基（minimalmedium，MM）：可以满足一般

微生物野生型菌株生长需要的培养基。完全培养基（completemedium，CM）：在基本培养基

中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基。用[＋]来表示。补充培养基（supplementalmedium，SM）：在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基。筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型。2、淘汰野生型

抗生素法：抗生素法是利用野生型菌株能在MM中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。高温杀菌法：利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。3、检出营养缺陷型

营养缺陷型在完全培养基上生长良好，而在基本培养基上则不生长，野生型都能生长。检出营养缺陷型菌株的方法有影印法、点种法、夹层法、限量补充培养法本次试验我们采用点种法点种法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。4、鉴定营养缺陷型：单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。实验材料芽孢杆菌细菌完全培养基细菌基本培养基无氮基本培养基青霉素溶液10000u/mL。生理盐水亚硝基胍溶液补充培养基(限制培养基)基本培养基加混合氨基酸溶液

在配制基本培养基时，将20种氨基酸分别依次缺少一种而使其中含有其他19种氨基酸然后接入待测菌，在哪种培养基上不长菌，就是缺哪种氨基酸的营养缺陷型。实验仪器台式离心机旋涡混合器恒温培养箱无菌生理盐水和无菌器皿三角瓶实验方法

菌种活化菌悬液的制备诱变育种抗生素法淘汰野生型（青霉素法）突变株的筛选菌种活化将实验室保存的野生菌种转接到斜面培养基,37℃培养24h,供扩大培养。2、菌悬液的制备①用灭菌的接种环将芽孢杆菌接种到盛有20ml完全培养液的250ml锥形瓶中，30℃振荡培养18~24h再取1mL过夜的培养液转接于另一盛有20mL完全培养液的250mL锥形瓶中，30℃振荡培养6~7h，使细胞处于对数生长期，以便使其发生突变。诱变处理注意事项NTG是一种超诱变剂，需小心操作。称量药品时，戴好塑料手套和口罩，称量纸用完后立即烧毁。溶液外溢时，用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布擦洗.诱变处理后含NTG的磷酸缓冲液及稀释液，立即倒入浓NaOH溶液中，若手接触NTG，应立即用水冲洗。NTG在可见光下会放出NO，使溶液颜色由土黄色变为黄绿色，故应放在棕色瓶中保存。诱变处理分别称取0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg亚硝基胍(NTG)于4支无菌离心管中，再加0.05mL甲酰胺助溶，然后加入0.2mol/LpH6.0磷酸缓冲液1mL，使完全溶解，用黑纸包好在37℃水浴中保温(临时配制)。②分别取4mL细胞悬浮液加入上四只述离心管中，充分混匀，立即置37℃水浴振荡处理30min，离心管中NTG的最终浓度分别为50ug/mL60ug/mL、70ug/mL、80ug/mL后，3500r/min离心10min,收集菌体，将含NTG的上清液倒入浓氢氧化钠溶液中弃去，用无菌水洗涤菌体3次，以大量稀释法终止NTG的诱变作用。③将诱变处理洗涤过的菌液，加入装有20ml完全培养基的250ml锥形瓶中，37℃振荡培养过夜。4抗生素法淘汰野生型（青霉素法）①饥饿培养：吸取5毫升处理过的菌液接入已灭菌的离心管，离心（3500r/min）10分钟。倒去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，离心洗涤三次，加生理盐水到原体积，用无氮培养基培养，30℃振荡培养4~6h。②加青霉素：将上述经饥饿培养的菌液，3500r/min离心10min，加到二倍氮源20mL液体基本培养基中，30℃振荡培养3~4h，待野生型细胞刚进入对数生长期，加入青霉素的终浓度一般为50~100u/mL，同时加入无菌的20%蔗糖和0.2%MgSO4，再继续培养5~6h，达到淘汰野生型、浓缩缺陷型目的。③制备菌悬液：取10mL上述菌液，3500r/min离心10min。弃上清液，菌体用生理盐水洗涤一次，再加10mL生理盐水制备菌悬液。5、突变株的筛选①突变株的筛选a、取无菌平皿两个，在底面外表用笔划分若干等份（按培养皿大小分为合适的大小），分别编号为1和2，培养皿1中加入完全培养基，培养皿2中加入基本培养基，室温凝固。b、于CM诱变平皿上选择微小型菌落，做好标记，然后用接种环挑取单只菌落涂于平皿1与2的同一位置，不断重复，接种时应注意先划线于基本培养基（培养皿2），后划线于完全培养基（培养皿1）。c、将划好种的两个培养皿置于37摄氏度培养48小时，观察结果，如某一菌落，在完全培养基上生长良好，在基本培养基上丝毫不长，则为营养缺陷型。d、挑取营养缺陷型的菌落接种于新的完全培养基平板中37摄氏度扩大培养48小时。营养缺陷型的筛选②营养缺陷型菌株的鉴定a、用接种环挑取培养好的营养缺陷型菌体，于10mL用无菌的生理盐水制成菌悬液。b、取1ml待鉴定营养缺陷型菌液，将其均匀涂布于基本培养基（MM）平板表面，用蘸有不同氨基酸混合液（下表，各氨基酸的浓度均为10mg/ml）的9片圆形无菌滤纸（直径约1cm）覆盖其上，28摄氏度培养2~3天，观察滤纸表面有无菌落长出，然后根据长出菌落的滤纸的不同组号，结合表格（如原