基因工程的基本程序

基因工程的基本程序第1页，课件共64页，创作于2023年2月基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第2页，课件共64页，创作于2023年2月一、目的基因的获取

目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因

获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成第3页，课件共64页，创作于2023年2月1.从基因文库中获取目的基因1)基因文库的概念:

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2)基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库第4页，课件共64页，创作于2023年2月基因组文库与部分基因文库的关系第5页，课件共64页，创作于2023年2月3)基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA第6页，课件共64页，创作于2023年2月基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?第7页，课件共64页，创作于2023年2月依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性4)从基因文库中得到目的基因的方法第8页，课件共64页，创作于2023年2月1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC第9页，课件共64页，创作于2023年2月2、利用PCR技术扩增目的基因第10页，课件共64页，创作于2023年2月PCR——聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。第11页，课件共64页，创作于2023年2月

以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n方式

使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增结果原理：DNA双链复制PCR技术第12页，课件共64页，创作于2023年2月前提：原料PCR扩增仪一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）第13页，课件共64页，创作于2023年2月PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一第14页，课件共64页，创作于2023年2月PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等第15页，课件共64页，创作于2023年2月反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成3.人工合成—化学合成法基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成第16页，课件共64页，创作于2023年2月3、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是①双链DNA分子为模板②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物⑧温度变化⑨恒温A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D第17页，课件共64页，创作于2023年2月4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个B1000个脱氧核苷酸对，即2000个核苷酸。由于A=T=460个，所以，C=G=540个。所以，一个目的基因有胞嘧啶脱氧核苷酸540个。扩增4代可产生16个DNA分子，根据DNA半保留复制原则，其中有一个DNA分子“相当”于亲代的DNA。所以，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸数为（16-1）*540=8100个。第18页，课件共64页，创作于2023年2月5、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法

B、基因组文库法C、cDNA文库法

D、聚合酶链反应6、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD第19页，课件共64页，创作于2023年2月二、基因表达载体的构建

——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?第20页，课件共64页，创作于2023年2月2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?第21页，课件共64页，创作于2023年2月启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第22页，课件共64页，创作于2023年2月①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第23页，课件共64页，创作于2023年2月基因表达载体除含有目的基因外，还需要以下元件：1、启动子2、终止子3、标记基因第24页，课件共64页，创作于2023年2月

已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素练习第25页，课件共64页，创作于2023年2月对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋－－预期三＋－＋－预期四＋－－－对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因第26页，课件共64页，创作于2023年2月基因表达载体除含有目的基因外，还需要以下元件：1、启动子2、终止子3、标记基因第27页，课件共64页，创作于2023年2月三.将目的基因导入受体细胞1.转化：2.方法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第28页，课件共64页，创作于2023年2月1、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染双子叶植物和裸子植物对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。①农杆菌特点：（1）农杆菌转化法第29页，课件共64页，创作于2023年2月③过程：适用于双子叶植物裸子植物第30页，课件共64页，创作于2023年2月原理：染色体的DNATi质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上第31页，课件共64页，创作于2023年2月农杆菌转化法中有二次拼接和二次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上TDNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA进入受体细胞。第32页，课件共64页，创作于2023年2月

因为动物体细胞的全能性受到一定限制，故一般将目的基因导入动物的受精卵或卵细胞，而不是体细胞；而植物体细胞的全能性相对容易表达，故一般将目的基因导入植物的体细胞，然后再通过植物组织培养技术获得转基因植株。第33页，课件共64页，创作于2023年2月（2）基因枪法:适用于单子叶植物（3）花粉管通道法适用于被子植物第34页，课件共64页，创作于2023年2月2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物第35页，课件共64页，创作于2023年2月3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：

繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子在低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。如大肠杆菌经CaCl2处理，成为容易受质粒DNA转化的细胞。第36页，课件共64页，创作于2023年2月

四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测第37页，课件共64页，创作于2023年2月1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)变性变性第38页，课件共64页，创作于2023年2月基因探针---是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。

根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。

基因探针来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针,另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段称为寡核苷酸探针第39页，课件共64页，创作于2023年2月？

为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。（通常采用同位素放射性标记，如用放射性同位素32P标记探针的核苷酸的磷酸基或用荧光标记等）探针为什么需带有一定的标记第40页，课件共64页，创作于2023年2月基因探针有哪些用途？DNA探针可以用于病毒性肝炎的诊断，遗传性疾病的诊断，可用于检测饮用水病毒含量等。

具体方法：用一个特定的DNA片段制成探针，与被测的病毒DNA杂交，从而把病毒检测出来。与传统方法相比具有快速、灵敏的特点。传统的检测一次，需几天或几个星期的时间，精确度不高，而用DNA探针只需一天。据报道，能从1吨水中检测出10个病毒来，精确度大大提高第41页，课件共64页，创作于2023年2月用目的基因作为基因探针，与待测DNA混合，若出现杂交带，说明二者互补。可以证明目的基因导入成功。第42页，课件共64页，创作于2023年2月下列有关“基因探针”的叙述，最恰当的是（）A．基因探针的工作原理是碱基互补配对B．待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因探C．基因探针技术可用于疾病诊断和环境监测D．以上都正确A对，基因探针的工作原理就是利用碱基互补配对原则进行工作；B对，待测DNA分子必须是单链，才能与探针进行碱基配对；C对，这是基因探针的用途。针测序第43页，课件共64页，创作于2023年2月1、鉴定——分子水平的鉴定变性方法——分子杂交技术(DNA和mRNA之间)（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA第44页，课件共64页，创作于2023年2月1、鉴定——分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养第45页，课件共64页，创作于2023年2月

第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；

第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；

第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；

第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。

由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。

具体做法是：

第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；

第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；

第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；

第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。

由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。

第一步：将目的基因在大肠杆菌(或其他生物）中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；

第二步：将表达出的蛋白质（相当于抗原）注射动物进行免 疫，产生相应的抗体，并提取出抗体；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；

第三步：由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，由于这种抗原—抗体的结合显示不出条由于这种抗原—抗体的结合显示不出条由于这种抗原—抗体的结合从转基因生物中提取蛋白质（相当于抗原）与将抗体杂交，若目的基因表达翻译成蛋白质，这时抗体与目的基因表达的蛋白质会特异结合，出现杂交带。第46页，课件共64页，创作于2023年2月2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。第47页，课件共64页，创作于2023年2月归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR人工合成（反转录法、化学方法）构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：第48页，课件共64页，创作于2023年2月第49页，课件共64页，创作于2023年2月1、基因表达载体必要的元件除目的基因外，还需有_______、_______和_________2、检测目的基因是否导入的方法________________；检测目的基因是否转录的方法___________________;检测目的基因是否翻译的方法____________________作业:金版P11--13第50页，课件共64页，创作于2023年2月练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的

处，DNA连接酶作用于

处。（填“a”或“b”）第51页，课件共64页，创作于2023年2月练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和

法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用

技术，该技术的核心是

和

。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的

作探针进行分子杂交检测，又要用

方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。第52页，课件共64页，创作于2023年2月答案：（1）aa（2）基因枪法（花粉管通道法）（3）植物组织培养（1分）脱分化（去分化）再分化（4）耐盐基因（目的基因）一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）第53页，课件共64页，创作于2023年2月①基因组文库的构建（2）基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因第54页，课件共64页，创作于2023年2月②cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)第55页，课件共64页，创作于2023年2月1)基因组文库是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体细菌的群体中储存，这个群体就称为该生物的基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。一、目的基因的获取基因组DNA限制酶基因重组转化细菌体外包装（一）从基因文库中直接获取1.基因文库第56页，课件共64页，创作于2023年2月1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有