五制分子生物学

五制分子生物学第1页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取---分（二）载体的选择与构建---选（三）目的DNA与载体连接---接（四）重组DNA转入受体细胞---转1、转化2、转染3、感染第2页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（四）重组DNA转入受体细胞---转1、转化：将重组质粒导入细菌或酵母细胞的过程。感受态细胞：容易接受外源DNA进入的细菌。转化方法：化学方法(氯化钙法)物理方法(电穿孔法)第3页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（四）重组DNA转入受体细胞---转1、转化：第4页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（四）重组DNA转入受体细胞---转2、转染：将外源DNA直接导入真核细胞的过程。（包括噬菌体导入细菌的过程）转化方法：化学方法(磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法)物理方法(显微注射法，电穿孔法)第5页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（四）重组DNA转入受体细胞---转2、转染：第6页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取---分（二）载体的选择与构建---选（三）目的DNA与载体连接---接（四）重组DNA转入受体细胞---转3、感染将外源DNA通过包装成病毒颗粒，然后导入到细胞的过程。第7页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取---分（二）载体的选择与构建---选（三）目的DNA与载体连接---接（四）重组DNA转入受体细胞---转1、转化2、转染3、感染第8页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取---分（二）载体的选择与构建---选（三）目的DNA与载体连接---接（四）重组DNA转入受体细胞---转（五）重组体的筛选与鉴定---筛第9页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取---分（二）载体的选择与构建---选（三）目的DNA与载体连接---接（四）重组DNA转入受体细胞---转（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选法3、亲和筛选法第10页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：含有抗生素的培养基上不含有载体的细菌含有载体的细菌是否含有外源DNA第11页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：载体上需要有两个筛选标志外源DNA插入其中一个筛选标志使其失去筛选作用另一个筛选标志仍发挥作用第12页，课件共41页，创作于2023年2月（2）利用基因的插入失活特性筛选：第13页，课件共41页，创作于2023年2月（2）利用基因的插入失活特性筛选：如何得到含有重组质粒的细菌？第14页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：载体上的标志基因表达，补救宿主细胞的缺陷基因，使细胞在选择性培养基上存活。第15页，课件共41页，创作于2023年2月1、遗传标志筛选法（3）利用标志补救筛选：第16页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选第17页，课件共41页，创作于2023年2月（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选第18页，课件共41页，创作于2023年2月（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选第19页，课件共41页，创作于2023年2月（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选第20页，课件共41页，创作于2023年2月（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选第21页，课件共41页，创作于2023年2月（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选X-gal蓝色产物-半乳糖苷酶第22页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：（4）利用噬菌体的包装特性筛选：第23页，课件共41页，创作于2023年2月

coscos12bp12bp48500bpNonessentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（4）利用噬菌体的包装特性筛选：重组λDNA的长度为其野生型长度的75%～105%时，才能包装形成有活性的噬菌体颗粒。第24页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸杂交法（4）DNA测序法第25页，课件共41页，创作于2023年2月三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：提取阳性克隆的重组DNA第26页，课件共41页，创作于2023年2月

Linearvector(2700bp)insert(300bp)

M空质粒重组质粒NcoIHindIII2700bp300bp提取阳性克隆的重组DNARE消化电泳有无DNA片段的插入；插入片段的大小三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：第27页，课件共41页，创作于2023年2月三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：提取阳性克隆的重组DNA第28页，课件共41页，创作于2023年2月（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：第29页，课件共41页，创作于2023年2月（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在a、提取阳性克隆重组DNAb、用特异引物进行PCRc、电泳PCR产物d、判断PCR产物是否与外源DNA一致NcoIHindIII2700bp300bp第30页，课件共41页，创作于2023年2月（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在（3）核酸杂交法：原位杂交鉴定阳性克隆第31页，课件共41页，创作于2023年2月（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在（3）核酸杂交法：原位杂交鉴定阳性克隆（4）DNA测序法：最准确的鉴定方法第32页，课件共41页，创作于2023年2月（五）重组体的筛选与鉴定---筛2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在（3）核酸杂交法：原位杂交鉴定阳性克隆（4）DNA测序法：最准确的鉴定方法3、亲和鉴定法：抗原-抗体反应Ab第33页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选3、亲和鉴定法第34页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：（4）利用噬菌体的包装特性筛选：2、序列特异性筛选3、亲和鉴定法第35页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（五）重组体的筛选与鉴定---筛1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸杂交法（4）DNA测序法3、亲和鉴定法第36页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术一、重组DNA技术中常用的工具酶二、重组DNA技术中常用的载体三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取（二）载体的选择与构建（三）目的DNA与载体连接（四）重组DNA转入受体细胞（五）重组体的筛选与鉴定（六）克隆基因的表达第37页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术一、重组DNA技术中常用的工具酶二、重组DNA技术中常用的载体三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（六）克隆基因的表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。蛋白表达系统是指由外源基因、载体、宿主和辅助成分组成的体系。第38页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术一、重组DNA技术中常用的工具酶二、重组DNA技术中常用的载体三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（六）克隆基因的表达蛋白表达系统是指由外源基因、载体、宿主和辅助成分组成的体系。第39页，课件共41页，创作于2023年2月第二节重组DNA技术二、重组DNA技术中常用的载体（一）克隆载体（二）表达载体1、原核表达载体2、真核表达载体三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（六）克隆基因的表达1、