遗传代谢性疾病的基因诊断

关于遗传代谢性疾病的基因诊断第1页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

主要内容前言一、基因诊断技术二、遗传代谢性疾病的基因诊断第2页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须依赖不断进行的物质代谢过程。物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白异常所致。根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发性。

前言

返回章二、代谢性疾病的诊断手段一、代谢性疾病的分类第3页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三一、代谢性疾病的分类原发性代谢性疾病：又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，造成具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。继发性代谢性疾病：继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。

返回节第4页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三二、代谢性疾病的诊断手段过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的生物化学方面的诊断现在：生化诊断+基因诊断

返回节第5页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断的概念

基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法,直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。

返回节第6页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断的特点针对性强特异性高灵敏度高适用性强诊断范围广

返回节第7页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

第一节基因诊断技术二.聚合酶链反应技术三.毛细管电泳技术四.基因芯片技术一.DNA测序技术

返回章第8页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三一、DNA测序技术

所有生物基因组序列的数据均来自DNA测序特点:稳定简便自动化程度高数据准确可靠公认为国际金标准

返回节第9页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三双脱氧链终止法原理:测序基础是以ddNTP为测序反应的链终止剂掺入到延伸链中的ddNTP可阻止后续ddNTP或dNTP的掺入

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返回节第11页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三示例：BigDye™Terminators循环测序反应扩增到未端为BigDye™Terminators的一系列的核苷酸链。循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多余的未反应的BigDye™Terminators。电泳与结果分析。

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返回节第13页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三焦磷酸测序技术原理:

引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。

返回节第14页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

返回节ABDNAPolymeraseACCTTGAATTCGTCCTAGGA……GGATCTT……dNTPApyrase(d)NMPPPiATPATP-sulphurylaseLuciferaseLightCTGCTTAAAGTCAGTCAGTCAGTC第15页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基本流程：第1步一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。

返回节第16页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基本流程：第2步向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。

返回节(DNA)n+dNTP(DNA)n+1+PPi聚合酶第17页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基本流程：第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相匹配的碱基数成正比。

返回节第18页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基本流程：第4步反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

返回节dNTPdNDP+dNMP+PiATPADP+AMP+PiATP双磷酸酶ATP双磷酸酶第19页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基本流程：第5步加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA

序列信息

返回节DNA序列GGCC-TAAGGGCCCTT核苷酸递增第20页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

返回节焦磷酸盐测序法步骤第21页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三二、聚合酶链反应技术PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。四种主要成分：

DNA模板、引物、DNA聚合酶和dNTP。三个反复步骤：

高温变性、低温退火和适温延伸。

返回节第22页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三三、毛细管电泳技术毛细管电泳统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分间淌度和分配行为上的差异来实现分离的一类分离技术。基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析。

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返回节变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的高通量筛选DNA序列变异的技术，其原理是利用离子对反向高效液相色谱原理,通过一个DNA分离柱，进行核苷酸片段的分离和分析。第24页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三四、基因芯片技术

基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交，通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取不同样品分子的数量和大量生物信息，从而可对基因序列及功能进行大规模和高通量的研究。

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第二节遗传代谢性疾病的基因诊断

遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的改变，从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾病。一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略二、苯丙酮酸尿症（PKU)三、同型胱氨酸尿症(HCU)四、酪氨酸血症五、半乳糖血症六、糖原累积症七、果糖不耐症八、家族性高脂蛋白血症九、肝豆状核变性十、先天性甲状腺功能低下十一、溶酶体病十二、线粒体病

返回章第26页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三遗传代谢性疾病的病理生理改变特征代谢途径的某些终末产物缺乏受累代谢途径中间和或旁路代谢产物大量蓄积由于代谢连径受阻而导致对肝、脑、肌肉等蛆织能量供应不足一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略

返回节第27页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三遗传代谢性疾病的发病特点父母双方或者某一方携带着致病基因。多在新生儿期、幼儿或儿童期发病，有些虽然在成人期发病，但在儿童期已有潜在病变。临床表现无特异性，多为胃肠道、呼吸系统、神经系统症状、代谢性酸中毒。家族史中往往有同样病情的先证者存在，而且往往因为饮食和应激等因素而发病。

返回节第28页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三代谢性疾病的基因诊断策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的致病基因检测表型克隆基因

返回节第29页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三二、苯丙酮酸尿症(PKU)氨基酸代谢障碍属常染色体隐性遗传我国发病率约为1/16,500

返回节第30页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因是由于人类肝细胞内苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏或活性降低所致。上述酶的缺乏或活性降低直接导致体内来源于食物的苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，从而使苯丙氨酸在体内异常蓄积，并打破大脑氨基酸的平衡而导致PKU。

返回节第31页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三临床表现神经系统症状：以智力发育落后为主的障碍。外貌：患儿在出生数月后因黑色素合成不足，毛发、皮肤和虹膜色泽变浅。其他：呕吐和皮肤湿疹常见；尿和汗液有鼠尿臭味。

返回节第32页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

基因诊断PAH基因定位于12号染色体的长臂上，即12q24.1，包括13个外显子和12个内含子，编码451个氨基酸的酶单体。PAH基因除了缺失突变外，大多是点突变。由于PKU是第一个可以用饮食控制治疗的遗传病，因此，对PKU产前诊断的研究是非常有意义的。

返回节第33页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三第34页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三三、同型胱氨酸尿症(HCU)是蛋氨酸先天代谢障碍所致的氨基酸代谢缺陷性疾病。常染色体隐性遗传病。基本病因是胱硫醚合成酶(CBS)缺乏或活性降低导致尿中的同型胱氨酸和蛋氨酸增高。

返回节第35页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因胱硫醚合成酶缺乏型(简称“合成酶型”)，是由同型胱氨酸变为胱硫醚的代谢途径发生阻滞,本型最为多见。甲基四氨叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶缺乏型(简称“甲基转移酶型”)，是同型半胱氨酸变为蛋氨酸的代谢途径发生紊乱。5,10-N-甲烯四氢叶酸还原酶缺乏型(简称“还原酶型”)。

返回节第36页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三临床表现典型的症状见于胱硫醚合成酶缺乏型的病例,患儿初生时正常，5～9个月间起病,主要症状是骨骼异常、晶体脱位、血栓形成、智力发育落后、惊厥等。“甲基转移酶缺乏型”症状较轻，可有骨骼畸形，体格和智力发育迟缓。“还原酶缺乏型”以神经系统状为主，如惊厥、智力低下、精神分裂症状、肌病等。

返回节第37页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断目前的基因诊断主要集中于分析胱硫醚合成酶的基因型。可通过绒毛膜绒毛取样(CVS)和羊水诊断来对已有HCU患儿的家庭中的其他成员进行产前诊断。

返回节第38页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

返回节第39页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三四、酪氨酸血症芳香族氨基酸代谢缺陷病常染色体隐性遗传发病率约为1/10,000特征是血液中的酪氨酸水平增高

返回节第40页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因酪氨酸在其分解代谢途径中需要一系列酶的参与，当这些酶缺乏时会导致酪氨酸在组织和器官的堆积，从而使血液的酷氨酸水平增高，并最终导致一系列的临床症状。

返回节第41页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三分型酪氨酸血症I型:延胡索酸酰乙酰乙酸水解酶缺乏酪氨酸血症II型:酪氨酸转氨酶缺乏酪氨酸血症III型:对羟苯基丙酮酸双氧化酶缺乏

返回节第42页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断酪氨酸血症的基因诊断主要依靠对FAH、HPD和TAT基因的突变筛选。研究者已经确认了可导致酪氨酸血症I型的40种FAH突变，这些突变可导致该酶的不稳定或失活，从而导致使该酶的活性降低或缺失。研究者已经确认了10种以上的TAT基因突变，而且，几乎所有的TAT基因突变可导致酪氨酸血症II型。研究者已确认HPD基因的一些突变可导致酪氨酸血症III型，其中一些突变影响该酶的正确组装。

返回节第43页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三五、半乳糖血症是一种糖代谢紊乱性疾病。常染色体隐性遗传。发病率大约为1/60,000。机体无法处理半乳糖而导致1-磷酸半乳糖的沉积而致病。

返回节第44页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因

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半乳糖代谢途径中酶的遗传性缺陷所造成的代谢性疾病。半乳糖半乳糖-1-磷酸GAKL1(2)UDP-葡萄糖UDP-半乳糖葡萄糖-1-磷酸GALE(3)GALT(1)第45页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三临床表现半乳糖-l-磷酸尿苷酰转移酶(GALT)缺乏型(最常见，病情最重)。半乳糖激酶(GALK1)缺乏型。尿苷二磷酸半乳糖-4-表异构酶(GALE)缺乏型半乳糖血症。

返回节第46页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断GALT位于9p13,GALT基因的大部分突变可导致GALT酶活性急剧降低或完全缺失。GALK1位于17q24，GALK1基因的大部分突变可导致半乳糖激酶氨基酸序列的改变。GALE位于人类染色体的1p36～p35，GALE基因突变可导致两种亚型的尿苷二磷酸半乳糖-4-表异构酶缺乏型半乳糖血症，分别是良性和恶性。

返回节第47页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三六、糖原累积症是一组较少见的婴幼儿先天性隐性遗传性糖原代谢紊乱性疾病。常染色体隐性遗传。常见于男性，多在婴儿期发病，儿童期死亡，少数可活到成年。尚无特效疗法，主要是对症处理。

返回节第48页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因与临床表现GSD多数是由于糖原代谢酶的缺陷而导致糖原分解或合成障碍，从而产生不同组织器官中糖原或异型糖原的过多累积。主要受累的脏器有肝、肾、肌肉、脑和小肠等。

返回节第49页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

返回节第50页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三分型GSD依其所缺陷的酶可分为11种亚型。又可根据糖原贮积的主要器官分为肝型、心型、肌型。其中以肝型较多见，肝型包括I型、III型、IV型、VI型、VIII型；心型为II型；肌型为V型及VII型。

返回节第51页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断可通过各型缺陷酶编码基因的突变来分析和预测是否存在糖原累积病。如对GSDII型，α-1,4-葡萄糖苷酶的已知的100多个突变位点与GSDII型的发病有关。

返回节第52页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三七、果糖不耐症糖代谢紊乱疾病常染色体隐性遗传

返回节第53页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因果糖不耐症是由于果糖二磷酸醛缩酶缺陷所致。由于缺乏果糖二磷酸醛缩酶，使机体不能使用果糖的一种疾病，其结果是果糖的副产品——果糖1-磷酸半乳糖在体内累积，而妨碍了糖原的形成和糖原转化成葡萄糖作为能量使用。

返回节第54页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

基因诊断果糖二磷酸醛缩酶的分子量为160000，由4个亚单位组成。根据其催化活性、免疫特征和在不同组织中的分布情况，又可分为A、B、C三型同功酶。肝、肾和小肠中以B型果糖二磷酸醛缩酶为主。欧洲资料表明：A149p、174D和N334k三种点突变是导致果糖不耐症的最主要原因。

返回节第55页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三八、家族性高脂蛋白血症高脂蛋白血症指的是血清脂蛋白浓度升高。高脂蛋白血症分类方法很多，按病因清楚与否分为原发性和继发性两类。继发性高脂蛋白血症是指由其他已知疾病引起的高脂蛋白血症。原发性高脂蛋白血症又分为家族性高脂蛋白血症和散发性，前者的家族成员可出现本病；后者无遗传因素，也无继发因素。

返回节第56页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三病因与临床表现I型高脂蛋白血症是脂蛋白脂肪酶或脂肪酶活化蛋白apoC-II缺乏所导致的一种较为少见的家族遗传性疾病，表现为血液中的乳糜微粒和VLDL甘油三酯的清除障碍，其特征是血液中的乳糜微粒和TG水平增高，常于幼年发病。

返回节第57页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三II型高脂蛋白血症家族性高胆固醇血症：

病因是细胞的LDL受体缺如或缺乏，导致LDL清除延迟而导致血浆LDL水平增高。家族复合性高脂血症：

病因是肝细胞产生apo-B过多。家族性载脂蛋白B缺陷症：

病因是apo-B基因突变导致apo-B蛋白(LDL的主要蛋白)难于或不能被LDL受体识别，其LDL水平代于家族性高胆固醇血症。

返回节第58页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三III型高脂蛋白血症几乎总是有载脂蛋白E的异常和血浆VLDL的转化和清除缺陷。

返回节第59页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三IV型高脂蛋白血症是较常见的家族性疾病，常具有家族性分布，其特征是血液中富含VLDL的TG呈不同水平的增高，有易感动脉硬化症的可能性，常于青春期或成人期早期发病。

返回节第60页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三V型高脂蛋白血症是一种较为少见的家族性疾病，其病因是内源性和外源性TG的清除功能存在缺陷，其特征是血液乳糜微粒和TG水平增高，而LDL和HDL水平降低，常于儿童或成年发病，易于发生危及生命的胰腺炎。

返回节第61页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三基因诊断除III型高脂蛋白血症是常染色体隐性遗传外，其他型别的高脂蛋白血症均是常染色体显性遗传。常规诊断主要依靠血液脂类水平确定高脂血症的类型。对于家族性高脂蛋白血症疑似患者，还需要对其父母、子女和兄弟姐妹在内的一级亲属进行相应的检测。基因诊断才刚开始应用于家族性高脂蛋白血症，如已确认了位于人类染色体11q23的APOA5的基因突变可导致V型高脂蛋白血症。

返回节第62页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三九、肝豆状核变性是一种少见的常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，家族性多发，患者多为儿童及青少年。特征是肝脏不能将铜排入胆汁，从而导致铜在肝脏、中枢神经系统、肾脏等脏器聚集并对其造成损伤。

返回节第63页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三肝豆状核变性的病因是位于人类染色体13q14.3～q21.1的ATP7B基因。研究者已确认了可导致肝豆状核变性的200多个ATP7B基因突变位点，其中，约半数的突变导致ATP7B蛋白单个氨基酸的错误替换。

返回节第64页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三十、先天性甲状腺功能低下

甲状腺功能低下是由于甲状腺激素分泌减少所致的疾病先天性甲状腺功能低下的病因是患儿的甲状腺先天性缺陷，表现为甲状腺发育或功能异常。DUOX2、PAX8、SLC5A5、TG、TPO、TSHB、TSHR基因的突变可导致先天性甲状腺功能低下。

返回节第65页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三十一、溶酶体病机体由于基因缺陷，可使溶酶体中缺少某种水解酶，致使相应作用物不能降解而积蓄在溶酶体中，造成细胞代谢障阻，形成溶酶体贮积病，又称为溶酶体病。

返回节第66页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三

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先天性溶酶体病是由于溶酶体酶缺陷而引起的遗传性疾病，现已发现有四十几种先天性溶酶体病是由于溶酶体缺乏某些酶而引起的，由于溶酶体缺乏某些酶，相应的作用底物不能被分解而积累于溶酶体内，表现为溶酶体过载现象，而导致疾病的发生。第67页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三十二、线粒体病线粒体是生物体内从食物获取能量的主要装置

返回节第68页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三氧化磷酸化是指线粒体呼吸链电子传递过程中ADP生成AT