细胞工程第8章 动物克隆与核移植技术

动物克隆与核移植技术克隆(clone)是指用无性方式产生的后代群体。分子水平：基因克隆细胞水平：细胞克隆个体水平：动物、植物克隆动物克隆指不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同的动物个体的技术。动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。动物克隆技术包括细胞核移植技术和卵裂球培养、胚胎分割技术。核移植技术：利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。

核移植技术最早由德国著名胚胎学家Spemann于1938年首次提出,研究工作主要集中在两栖动物和鱼类。哺乳动物的核移植研究始于1969年,但由于其卵母细胞较小,而且是体内发育,给研究工作带来一定难度。1995年首次用胚盘细胞作为供体细胞培养出了2头羊,它标志着哺乳动物体细胞核移植的开端。1997年首次以成年绵羊乳腺上皮细胞为核供体的克隆羊“多莉”成功诞生，证明了高度分化的体细胞仍具有全能性。之后相继以体细胞为核供体培养出了克隆小鼠、牛、山羊、猪等。核移植技术简史核移植技术类型供体细胞核的来源胚胎细胞核移植体细胞核移植核移植目的生殖性克隆（克隆人）治疗性克隆（克隆胚胎）供受体种间关系同种核移植异种核移植核移植技术的一般操作程序（重点）

1．核受体细胞的准备2．核供体细胞的准备3．细胞核移植4．激活5．重组胚的体内或体外培养6．胚胎移植1．核受体细胞的准备

核移植的受体细胞常为去核卵母细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二是收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。核移植技术的一般操作程序2．核供体细胞的准备

在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。

供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。

核移植技术的一般操作程序3．细胞核移植常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。核移植技术的一般操作程序4．激活

卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激等方法使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。

核移植技术的一般操作程序5．重组胚的体内或体外培养

经融合和激活的重组胚移入中间受体进行体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。核移植技术的一般操作程序6．胚胎移植

重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。核移植技术的一般操作程序克隆羊与体细胞核移植卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。多利羊的成功提示我们，在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。核移植技术的应用1．制备转基因克隆动物，

进行生物药物生产；2．培育优良畜种，扩大良种种群；3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物；4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题。克隆技术存在的问题

理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基