食品酶学课件本第三章酶的分离纯化第四节分离方法

第三章酶的分离纯化概述第一节起始材料的选择第二节细胞破碎第三节酶的提取第四节分离方法第五节酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价复习题7/3/20231分离方法分述一、离心分离法二、过滤与膜分离三、沉淀分离法四、层析分离法五、电泳分离法六、酶的结晶七、浓缩与干燥7/3/20232四、层析分离法原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。7/3/20233（一）吸附层析法1、概念吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。图2、吸附剂硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例一般在低pH值、低离子强度的条件下对酶进行吸附，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可解吸洗脱出来。3、吸附层析方法①吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；②把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加洗脱剂，使酶解吸而洗脱出来。4、特点与应用设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的层析分离技术。

枯草杆菌α-淀粉酶在弱酸性条件下，可吸附在氧化铝上，再用pH8～9的Na3PO3溶液洗脱；中性蛋白酶可在pH6.5～8.5条件下，用硅藻土吸附，再在pH9～11.5的2%氯化钠溶液中洗脱出来。7/3/20234吸附层析法图7/3/20235（二）离子交换层析1、原理：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离。

2、离子交换剂的构成：基质、功能基团（电荷基团）、反离子。羧甲基纤维素（CM-纤维素）：纤维素-O-CH2-COO-Na反离子基质电荷基团3、离子交换剂的种类4、离子交换剂的选择5、离子交换层析的操作流程6、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存、分辨率高、测定蛋白质的等电点。7/3/20236离子交换原理图7/3/202373、离子交换剂的种类基质电荷基团疏水性：人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离小分子物质。大孔树脂可用于酶。（离子交换树脂）亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。（离子交换纤维素、离子交换凝胶）阳离子交换剂：电荷基团为（-），反离子为（+），与溶液中的阳离子交换，分为强型和弱型阴离子交换剂：电荷基团为（+），反离子为（-），与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型常用的离子交换介（基）质

离子交换剂保存剂7/3/20238亲水性离子交换剂离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、AE-纤维素、CMC（羧甲基纤维素）等。离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换和分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SP（磺酸丙基）葡聚糖凝胶等。

7/3/20239常用诞离子鸣交换篇介质6/巴27买/2猜02打310离子字交换眉剂保纳存剂6/略27般/2鼓02奏3114、离赤子交案换剂把的选壤择强弱历离子好交换董剂的会选择：强型盘：适键用范灰围广曲，无咽离子蜜水中衫或极服端pH条件肿下稳灶定。弱型挽：适膛用范补围窄棋，适拍合分渔离生迁物大推分子僵物质灿。酶蛋咽白的pI为6-帮9时，笋考虑删用强慰型离练子交矩换剂扁。基质撕的选桐择：分离孟有活蜘性的罩生物催大分妇子物玩质时部，亲驳水性堂好于火疏水外性。离子菌交换劲剂类昌型的枪选择：考虑透酶的告稳定哭性酶在pH＜pI的条暂件下岭稳定仁，酶梁带正掠电，波用阳栋离子绸交换错剂；酶在pH＞pI的条灯件下贝稳定幸，酶方带负徐电，许用阴结离子许交换你剂；在两前种条婆件下征都稳孔定时裤，二屑种交俱换剂项都可挠应用羊。6/饰27凭/2迫02伐3125、离疤子交昌换层博析操颜作流长程①离厕子交缸换剂减可装忽成离殃子交溪换柱针进行柱层析驶；②可川将离惑子交艘换剂妙加到正酶液棕中，催待交转换后摔，将角离子圈交换砌剂过劈燕滤分言离出含来，接再用鬼洗脱既剂将位酶洗色脱出越来。离子皱交换森柱层逐析主冻要操双作过谅程：（1）离薯子交鹿换剂辫的处监理与申装柱（2）上新柱（3）洗眨脱和例收集（4）离貌子交夜换剂枯的再盐生6/役27套/2盗02蹄313（1）离悠子交柴换剂馋的处号理与醒装柱①预罗处理羽：浸屯泡与误脱气将干陶燥的宫离子腾交换尝剂用棒水浸伟泡2h以上域，充究分吸敞水膨诸胀后呢，减伙压抽袄除气允泡，昼倾去蹈水，炼用无月离子似水洗沿至澄雕清。嫩再先荷后用4倍体洗积左单右的2m嗽ol辅/L盐酸循和2m欣ol希/L氢氧刷化钠贼浸泡诉各4h，再用拦无离徒子水臭洗至精中性裳。②转哲型经上竟述处涨理后毅的离踢子交鸟换剂澡需经陶转型骡，使躺离子化交换知剂所狼带的火可交难换离究子转狂变为雄适当孟的离注子型征。如性阳离币子交光换剂酷用Na辣OH处理硬，转隆为Na+型；斥用HC诸l处理唱，转冶为H+型。述阴离谢子交粮换剂齿用Na芝OH处理轿成OH-型；鲜用HC罪l处理兄成Cl-型等房诚。交额换剂桃在使芝用后复也需贪经转齐型，沃使之震得以立再生平以重酷复使杯用。③装累柱转型炭后的匀离子羡交换决剂小循心地荐装进纤交换下柱。砍装柱驻的好租坏对甜分离动效果挤有影贷响，逮要求蛛装填英得均匀东，无皆气泡悲，无外裂纹。装伙好后甲，保滥持液标面在草交换域剂平狠面以晌上，仓防止将空气壳进入异。6/成27鼓/2扣02越314（2）上波柱①样萍品液急的控蒜制：上丹柱时凶要注扭意酶详液的pH值、跌温度跨和离吓子强守度等条古件。②上悔柱：打暂开离忙子交逢换柱华出口孔阀，咬让柱蒙内液银体慢民慢流闸出。送当液夏面刚蜂好到粗达交街换剂岂表面茫时，执小心符加进碑酶液御，使迈酶液夏尽快均匀地分柴布于举交换妄剂全墨表面巩，然茄后均织匀进危入交巧换剂忧层进塘行离铅子交晚换。踩继续带加入扁酶液哑，直定至交茧换剂疲的交馅换容孤量饱和为止需。③流矩速的留控制：要催控制便好流速。流咸速太乐快，捆分离即效果膜不好质；流挑速太辆慢，闷则影锐响分任离速错度。涨有时勺由于讲离子份交换忠剂颗努粒太赢细，屋或柱越较高限，或登酶液钥浓度公、粘隔度较傍高等善原因丝式引起撇流速牺太慢拆时，升为加快慌离子荒交换西层析爹速度，可劳采用求在柱漫进口死适当加压或在普出口历适当减压的方泄法。6/供27元/2拾02躲315（3）洗册脱和筒收集①洗学未吸称附物上柱慎完毕暑后，绘先用姥水或壤缓冲婆液流品过层腾析柱球，使团未吸演附的著物质镰洗出讨。②洗轰脱目廊标物用适旦当的帖洗脱宜液，棒将吸刺附在迈离子鉴交换中剂上勒的离缘瑞子按亲劳和力敌自小仍至大值的顺锻序逐怜次洗亡脱下来化，分别域收集，以盗达到奴分离逆目的善。若酶凤液组关分很蜘复杂雾，用峰一种构洗脱沸液还使达不押到良朴好的凑分离采效果懂。为必此，胶可采太用连叶续或志阶梯晶式的梯度准洗脱悬法。即历采用贯按一示定规桥律改牢变pH值（pH值梯咱度）炸或盐拜浓度澡（浓童度梯野度）舌的洗旁脱液琴进行岂洗脱狐。连续躺梯度抓洗脱内液可按公预先浑设计鸭的梯励度范毯围，串在梯为度混氧合器育中配进置。锹而阶梯盗式梯狂度洗订脱液则分任别配截置几秆种不虑同pH值或拦不同波盐浓短度的电缓冲愤液，拔使用或时按态设计征好次勉序依逝次洗误脱。6/绕27膀/2惯02陪316（4）离绪子交眼换剂岛的再命生洗脱宪收集榴完毕娃后，洪为使秋离子纵交换华剂再答次使倚用，浸需要含经过慰再生勿处理叫。①含杂质车较少时，望再生罪只要栋用酸油、碱脑或盐突进行转型即可牺；②含杂质撇较多的情怜况下领，再而生时免要先科经过酸、娇碱浸按泡清洗葱，用事水洗族至中哀性，焦然后再转蹄型，以膛备再征次上瘦柱进快行交搬换。堵如此凭循环轨往复倘，离铺子交况换剂妻可反怎复使竹用一涛段较市长的乎时间涛。如离勉子交删换柱只要较拉长时航间停允用，龙可在滤再生开后，讯加入由适当下的防腐插剂以防暗止微愉生物带生长获。阳剩离子凳交换率树脂僻常用0.陆02贝%的叠留氮钠作为放防腐出剂。钢而阴强离子胡交换卸树脂馒常用脾的防躬腐剂染是10颗pp页m的苯桃乙酸薄汞等。6/远27借/2电02势317（三他）凝原胶过肠滤层训析1、原进理：依据装分子笛筛效调应，玩按分升子的大小定和形逃状来分膝离样套品。当样王品经去过分撞子筛耳介质底时，项由于衬分子捎筛有斯一定傍大小故和孔皆径，屠小分折子样方品进短入颗黄粒内团部，筒大分喝子由初于进股不了贵颗粒娱内部阵而直转接流挖出来趋，它屠与进颗入颗寄粒的路小分场子相冒比，这流过粒柱的荐路程宏相对民较短低。2、分邻配系须数（Kd）：反映泛凝胶虫对溶脸质排授阻程思度的量。Kd值的证意义Kd值的板计算3、凝胶青种类：葡聚傻糖凝桥胶、琼脂愚糖凝回胶、聚丙碗烯酰立胺凝领胶常用本凝胶应过滤逼层析搁介质4、影炎响凝叔胶过晕滤的姜因素墓：5、凝储胶过云滤层桨析的拣应用榜：Ve-VoViKd=6/赤27穿/2串02扭3181、凝饲胶过林滤层铁析的馅原理6/丛27纪/2船02怠3192、分爱配系化数为了纷定量荒地衡非量各虑组分腰的流朱出顺滚序，惰常常态采用捧分配须系数Kd来量歪度。Kd值是反映权凝胶质对溶暗质排笛阻程西度的喊量。Ve：某组防分的告洗脱强体积紧，该丢组分液从加久进层馒析柱足到流组出液遣中该是组分星出现厚高峰概时所献用洗担脱液鼻体积（mL）Vo：外（瞒水）挣体积幸，层安析柱巾内凝那胶之盟间空统隙的器体积（mL）Vi：内（到水）文体积借，层迎析柱惭内凝机胶颗氏粒内费部微妇孔的谋体积(mL)6/弟27如/2病02质320（1）Kd值的敬意义Kd=0时即Ve=Vo，该组暴分足膜够大势，不直能进虽入微喜孔，庄最先豆流出诵。Kd=1时即Ve=Vo+Vi，该组其分可哥进入供全部扫的微着孔，梢最后锻流出幕。0<Kd<1Kd小的向先流巧出，Kd大的丘后流优出。Kd可定量地衡贫量各哪组分毕的流从出顺效序，旷也是旨判断邮分离障效果欠的参确数。盘当Kd差异跨大时跳，分压离效绒果好扎，险差异因小时例，分粮离效杯果差石。Ve-VoViKd=6/宗27个/2唐02肃321（2）Kd值的丧计算Ve、Vo和Vi与凝显胶种截类、驶凝胶先型号桂、凝扮胶处春理方风法、视装柱播量的娇多少近以及兵装柱缠质量殿等因菊素都左有密潜切关界系。尖对于般不同班的凝戏胶柱谣，其置数值衔都往傲往不份同。皱所以种，需端要在附装好弃凝胶谋柱后神，在乘使用互于酶微液分注离之躲前，腿通过周试验窃，测定拼该层倚析柱既的Vo和Vi（图例喷），并对躬某些弯已知酬组分的Ve进行薪测定勾，从脱而计尺算出佩其Kd值。在凝戚胶柱税装好追后，胁要尽脏量维汽持相贴同的单使用移条件迁，使泻各组朵分的Kd值保草持一崇定，捡即保砖持各要组分精的流叹出顺错序，裹从而逼达到手良好总的分亮离效挠果。6/早27觉/2怨02霉322Vo和Vi的测肺定当把阔分子崇量不艰同的枣混合方溶液针铺在总凝胶乡丰床上乐时，营其在黄内水脑体积预和外源水体沸积中备的分吹布是剑不一热样的仰。Vo：溶液己中的督分子托大于固凝胶挨孔径卷上限傅者不浴能进厨入凝继胶网血孔内反，如蓝色腾葡聚糖都（bl胀uede邪xt巧ra述n，分子魄量约2便00忍000级0），而被功排阻据在外己水体县积的窜溶液途中。基凝胶烈床的窝洗脱讽体积Ve刚好木等于别外水榴体积洪。即Ve=V缸o僻(Kd=0扰)。Vi：溶液事中的拣分子速小于枣凝胶研孔径估下限绢者,（如T2O，tr抛it喇iu炊m拼ox咽id尺e，氧化蛇氚，嫁氚水携）能鞋自由滑进入仓凝胶贯网孔申内，划凝胶渣床的残洗脱蚁体积Ve应等仗于凝复胶床辱总体洁积，抖即Ve=Vt=浑Vo肃+V拒i凉(Kd=1钓)。也可从凝大胶干、面湿重超差求得油。而溶蜡液中稍的分卖子大袄小介扬于凝士胶孔桶径上烫限和蛛下限浅之间虎者，质则能踢进入糠部分家凝胶丹网孔倦中，聚故其乔洗脱强体积Ve是在Vo和Vt之间躬（Kd在0～1之间塞）。6/千27适/2灶02商323（1）葡救聚糖采凝胶构成蛙：以葡挣聚糖湿（葡猫萄糖家通过1，6糖苷趋键结兆合而教成的恋线性判高分征子）先为单想体，浙以1，2-环氧异氯丙本烷为练交联欢剂聚营合而成胆。Se绪ph搏ad徒ex：G值后索的数然值为成该类禁型凝食胶膨娘润时瞧吸水悦量的10倍。干如：G-汤25表示1g凝胶加可吸堪收2.宪5m娱l水。G值小据，吸粥水量械少，杨凝胶孔孔径疲小，殃适合均于较晶小分室子的竟分离顶；G值大菊，吸连水量遇多，赖凝胶陕孔径达大，损适合李于较婆大分逗子的楼分离掌。特点勤：有良配好的惊化学候稳定姐性（斧耐酸恳碱）他和热保稳定榴性，浙室温弦保存原要防达腐。葡聚短糖凝包胶系民酸性州物质越，能麦与碱斑性蛋汽白发医生吸袍附作况用。料当离子渴强度参大于0.景05时吸附距作用颤可丧版失。葡聚龟糖凝粮胶的动操作仪流程6/仍27齿/2机02贯324葡聚拼糖凝获胶的晕操作栽流程选择剖凝胶陕和溶胀：可根据抱分子聋量大竭小范充围选俯择凝肚胶，篮还有导粗中港细之洗分，孟粗分克用中蜓粗的挖凝胶搭，分敲析工质作用结细的挨凝胶型。水四浸过闲夜或昌沸水耽煮2h撕r（速度佳快且汤可以歪杀菌侨）。装柱：均匀宰、无绸纹路舌、无气泡痒（兰秆色葡聚疲糖20维00检验谈），用劳缓冲俩液平赴衡。上样芝和洗脱潜：体积不超泼过柱苗床体阳积的1/博4毯0。然飞后用扑缓冲逆液洗泽脱，酱注意仁流速止和操叫作压愿。再生：稀盐棵和缓蚀冲液失洗涤杨，保藏存在之液体毒中，凤为防菠止微迎生物记生长隔，抬加0.目02蝴%雀Na吊N3（使用静时可麻能会思抑制傍所要陡分离位的酶偿）。6/带27罢/2决02勒325（2）琼侍脂糖捉凝胶构成誉：由D-半乳访糖和3,屠6-脱水弃半乳姥糖连嚷接构额成的哈糖链之。本誓身不差包含辩另外渣的交园联物帽质，宋依靠谜糖基批之间呼的氢盼键作霉用形伙成稳离定的唐网状够结构舅。Se勾ph借ar远os趴e：数字算表示丙琼脂壁糖含窑量（2B表示汽含量令为2%），君数字猪越大公含量冬越高漆，但粉筛孔皂越小疲。特点终：孔径方较大纸，非视特异康吸附肝作用册小，早但稳躬定性株差。Se胆ph狡ar亡os汪e-C届L型乓：是琼译脂糖境在强示碱性朝条件冒下与1,跨3-二溴俗异丙阴醇生何成的交联溜型琼浆脂糖。孔裳径与古同浓基度未冬交联典琼脂贩糖相轨同，踏但热顶稳定丛性和膜化学执稳定鞋性都吼有提学高，赖可在0-价40℃、pH那3-辱14间使牌用。6/冒27烧/2筒02鼓326（3）聚搅丙烯肠酰胺业凝胶构成捉：人工桌合成挠凝胶辫。是稼以丙伴烯酰惯胺为个单体庸，以救甲叉燃双丙脉烯酰届胺为急交联口剂聚低合成家的高沿分子洋聚合韵物，件通过爹改变座单体炕和交齿联剂攀浓度猪可改愤变凝卸胶孔陆径。Bi须o-小ge责l迁P系列夺：P值越或大孔科径也皂越大索，数倡值*10奋00表示倡排阻太限度粉，可栽根据川欲分兼离的谈分子亮量选抗择适雅宜的池凝胶券。特点斑：属于秋惰性域凝胶尤，但论遇强理酸时神，可卖能使败其中塌的酰苦胺键雁水解夕而遭推到破之坏。6/循27叼/2丈02芦327厂家/商品名型号凝胶种类备注Bio-RedBio-gelPBio-gelAP-2、P-4、P-5P-10、P-30、P-60、P-100、P-150、P-200、P-300聚丙烯酰胺不同型号所排阻的蛋白质分子量不同A-0.5m、A-1.5m、A-5.0m、A-15m、A-50m、A-150m琼脂糖LKBUltrogelAgaroseACA22、ACA34、ACA44、ACA54、琼脂糖/聚丙烯酰胺A2、A4、A6琼脂糖PharmaciaSephadexSepharoseSephecrylG-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200葡聚糖6B、4B、2B琼脂糖CL-3B、CL-4B、CL-2B交联琼脂糖S-200、S-300、S-400、S-500、S-1000葡聚糖/双丙烯酰胺常用戴凝胶掩过滤达层析叼介质6/歼27存/2闸02驻3284、影捆响凝征胶过骂滤层梯析的棉因素选择暴合适纽奉的凝胶鸟粒度：细探颗粒闻凝胶茫分辨局率高盟，但铲洗脱趴慢；柱长：L/棉D高的游柱子阁分辨权率高绣，但摘影响预流速丝式；层析死柱的名装柱骨质量匪：减昏少气糖泡和软裂纹千；样品岭体积：量忆少，从分辨覆率清叙晰，参用于司分析脱目的扮时不雁超过柱床体欠积的5%，脱愉盐时10讯%左右齿。制馋备层妈析可25田%-作30魂%；洗脱铺液的流速：流拦速快某分辨寄率低耍。6/盛27刊/2傅02悼3295、凝旬胶过江滤层红析的腥应用生物冬大分扔子的禽脱盐克和浓傅缩；分离秋生命得物质党（对垃某些夫理化叛性质梢相似裹如溶爸解度大、带惕电性湾质等患，但便分子瓣量不纺同的汗混合裙液）艇；去除荡热源样物质绵；分子族量检伶测；其它云：DE它AE细-Se苹ph猜ad饱ex可作馆为离鸦子交横换层详析介盟质。6/垄27劫/2赴02计330（四骗）亲士和层孙析1、原石理：利用酬生物纤大分蒙子与烘配基甲之间煎所具热有的专一剥又可豆逆的结沾合，四将配足基共殖价连冈接在赌固相祝载体坐（基屡质）壶上，迫通过松层析家柱的验生物辈大分棉子就肿能以鼓其高雕亲和见力与堡配基不特异慈结合塞，与制其它料杂质针分离垦而达耀到纯机化目较的。亲和东层析望是从染复杂率混合就物中准纯化梳蛋白专质的捡最好敬的方底法。2、亲赠和层梦析基漆质和索配体拥：3、基警质与诵配体柿偶联绝：4、亲梅和层遥析操梁作步眨骤：5、亲膛和层循析的应用返：（6/照27弊/2轰02长3311、亲群和层茶析的单原理6/蝴27激/2萄02骡3322、亲俩和层润析基蛙质和别配体理想仇的基质应满廉足的狮条件将：（1）能榆构成采松散竿的多宴孔网守络；（2）努极低次的非晕特异廊性吸林附；（3）签高度揉的亲漂水性枝；（4）循较好偶的理煤化稳封定性阳；（5）具食有大拉量能盈活化先并与形配基碍结合龟的基平团。可供换选择昆的亲赚和层语析基采质：琼脂里糖、凭葡聚须糖、才聚丙刻烯酰绑胺、侨纤维么素等。以4%的交伪联琼旬脂糖丈（Se纱ph差ar缘瑞os释e4B）最为难常见。亲和用层析配体的条件抬：（1）与垃纯化槐的物盐质有或较强竞的亲索和力惯；（2）具糟有与危基质醒共价盘结合喷的基丹团。瞎如：虫底物洪、底区物类丈似物纺、别饮构酶皇的效遥应因偶子、评辅因拔子、畜抑制并剂、统抗体庸、染蚕料等睁。6/肝27代/2钥02掠333亲和冲层析洋的几挺个名懒词在成盏对互睛配的请生物吧分子酸中，收可把粥任何微一方纱作为固定心相，而推对样优品溶辆液（孔流动顶相）左中的辞另一精方分秃子进或行亲顿和层丛析。卵例如凝，酶天与其愚辅酶倦是分望子对辱，既帜可把僚辅酶羽作为木固定纸相，晶对样遵品液膏中的钻酶进梯行亲任和层龄析分汪离；鲜也可障把酶腰作为暮固定宏相，扇使样罪品液哑中的针辅酶默分离贸纯化悦。在上亲和虑层析招中，墨作为内固定球相的至一方样称为配体疤（配辉基）。配基苹必须朝偶联灰于不抢溶性岛母体负上。母体又称载体或担体或基质，一纲般采雾用琼扰脂糖狡凝胶铃、葡楼聚糖睁凝胶敲、聚华丙烯截酰胺休凝胶海和纤嘉维素午等作脉为母巡寿体。活化索后的帮不溶统性母尘体已版有商帆品出不售，辉商品冈名为偶联谜凝胶。6/僵27羊/2话02功3343、基敢质和近配体译的偶测联基质决的活碧化：CN乱Br法：作用瞒于葡睛聚糖敏或琼付脂糖灵的羟究基上界，形距成活逗泼的确亚氨嘴基碳氧酸盐疑衍生莲物。引入皂连接逃（手散）臂语：通过嫩直接目偶联雹的方榜式得脂到的末亲和疼吸附搭剂，嫂基质显和配祝基间拍距离匀较近撑，形稳成空医间位前阻，糊难于才进行公亲和构作用斜。通答常在鉴基质总与配龙体间丙引入街适当误长度蜻的连逼接臂袍。使模配基迁能自反由伸善入溶轿液而冬增进恋对酶拴分子划的吸散附效农率。壳常用皇的连扶接臂塘为二缓胺化寻合物竭。图例偶联雨：一般障在活士化后申快速剃进行凶。OHOHCN顽BrOOC=纯NHpH侮116/含27嘴/2传02蜘335亲和懒层析上连接龄臂的帐作用6/党27携/2飘02澡3