第二章 基因工程的理论基础与基本技术

第二章基因工程的理论基础与基本技术

第一节基因工程的理论基础（一）原核生物的基因结构特点1.操纵子结构

操纵子（Operon），由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位（coordinatedunite），称为操纵子。

一基因结构特点调节基因启动子操纵基因结构基因大肠杆菌乳糖操纵子

色氨酸操纵子

2.原核细胞mRNA的特征（1）半衰期短（2）多顺反子形式

（3）存在SD序列

原核生物中起始密码子AUG上游7～12个核苷酸序列因其与16SrRNA3’末端反向互补而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。

（4）起始密码子常为AUG（有时GUG，甚至UUG）。3.原核细胞基因的终止子根据对细菌和噬菌体DNA模板上的终止信号的分析，发现它们具有共同的结构特征：①终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构；②在终止点前面有一段由4～8个A组成的序列，因此转录产物的3’端为寡聚U。

UUUUUUUUUUUURNA（二忘）真疤核生梁物基赴因的壶结构逢特点1.真核布生物帝基因指的不染连续康性断裂屡基因品（in晌te桶rr胃up护te染d屋ge骄ne）内含喇子是一烛个基伏因中颠非编渔码DN购A片段畏，它士分开义相邻君的外鼠显子塑。外显己子是一假个基击因中度编码烘蛋白虫序列娱。严摊格地顺说,外显要子是睡指保允留在基初级mR证NA中不肯被剪挥切掉测的区是域,包括5’非翻晨译区(5亡’U刺TR栗)、编旗码序笼列和3’非翻旷译区(3垦’燥UT纤R)。外显信子-内含暖子连亭接区是指胆外显私子和抚内含款子的姐交界丈，又锻称边肃界序烦列。GT袍-A袭G法则序列除分析灰表明振，几句乎每僵个内兆含子5’端起签始的凳两个非碱基垦都是GT，3’端最肾后两矿个碱念基总抖是AG，由捉于这册两个伐碱基阶的高焰度保泊守性雪和存倒在的随广泛屈性，泳有人伏把它裕称为GT品-A雾G法则姿，即方：5’购G酸T秆…更AG舅3绍’。卫星DN傻A真核最生物享基因屡组中殖高度潮重复枝的DN融A,有一客些20～30惑bp的极替短序隙列，摊且以久数千具个拷跳贝的妄串连呆方式品排列葱，这男种序虑列称肉为卫轰星DN许A。2.卫星DN脊A在染握色体DN房诚A片段焦的氯吼化铯择密度叼梯度笼离心吼中，毕由于张浮力责密度塑的不异同，交这种描重复稍序列途在主漏带DN鼓A附近奏出现堡的卫订星带霞，因殖此称档之为免卫星DN广A。3.真核互生物mR衰NA的特舟征（1）5’端的头帽子朋结构几乎笨全部哭的真默核mR免NA端都虎具“视帽子械”结喘构。壳虽然惭真核增生物乡丰的mR乎NA的转打录以筋嘌呤赌核苷宗酸三雪磷酸舅（pp载pA肃G或pp童pG）领馆头，达但在5’端的挤一个粮核苷筛酸总拜是7-甲基袜鸟核缝苷三发磷酸丽（m7孔Gp敞pp盗AG念pN德p）。mR质NA灯5’端的纷这种蝇结构壶称为帽子（ca安p）。狼不同多真核窑生物则的mR叼NA具有寺不同侦的帽内子。(1统)有助写于mR乔NA越过灭核膜喜，进训入胞撕质；(2没)保护5′不被看核酶喂降解刑；(3心)翻译递时供IF袖Ⅲ（起欺始因残子）左和核谱糖体上识别住，是达翻译乏所必姐需的环。（2）3’末端Po寻ly（A）尾饭巴除了躺组蛋率白以掏外，成真核巷生物mR打NA德3帜’末端昂都有羞由40午~2礼00个A组成慎的Po腔ly（A）尾挪巴。Po携ly立(A)尾不翠是由DN您A编码梳的，桂而是洞转录满后的拌前体mR偶NA以AT灰P为前余体，闸由RN快A末端虫腺苷化酸转伶移酶，即Pl阿oy其(凶A)聚合棉酶催池化聚总合到3’末端住。mR英NA刚从张细胞稀核进接入细体胞质产时，铺其多洁聚(A呼)尾巴牲一般挡比较优长，撇随着mR康NA在细呈胞质喉内逗抄留时垫间延良长，劳多聚(A酒)逐渐职变短蚊消失采，mR据NA进入止降解自过程肥。它可抢促进祸核糖萌体的屡有效固循环灾。是mR危NA由细孩胞核夕进入踩细胞僚质所甩必需膝的形惑式；它大遇大提语高了mR慨NA在细康胞质困中的齿稳定疤性。Po炉ly（A）尾廉巴有鄙三个垫方面发的功必能：寡聚偷（dT）-纤维股素柱锻层析尤法常规证方法RN各A(高盐康缓冲腔液)寡聚号（dT）纤句维素约柱低盐杆溶液搭和蒸混馏水洗脱较高剧纯度魂的mR幸NA加样结合Dy筛na乓be稠ad找sOl舅ig松o(特dT浴)2钓5是一寨种直送径为2.绕8μ赢m的均偶一的件、超立顺磁兽的微赴球体带，其钻表面副的5’连接的键共羞价结芦合了棵由25个脱工氧核越糖核颠苷组劲成的讯长链烂。mR袍NA磁珠辟分离抗法二旋从DN沸A到蛋共白质（一亭）中壮心法汉则19貌70年特明(H吧.M让.Te制mi缴n)以在错劳斯蠢肉瘤以病毒汇内发伴现逆笛转录作酶这嘱一成布就进苍一步肃发展砌和完缝善了以“中顿心法妖则”暖。（二想）基蜜因表萄达从DN税A到蛋率白质禁的过努程称艰为基作因表孕达。DN斩ARN冈A转录翻译蛋白如质原核诱生物芳和真川核生慌物比亏较1.启动畏子2.掘RN料A聚合疤酶原核伞生物真核胶生物RN龙A聚合字酶仅棚一种RN史A聚合舍酶有榜三种RNA聚合酶Ⅰ大部分rRNARNA聚合酶ⅡmRNA和snRNARNA聚合酶ⅢtRNA和5sRNA全酶立的组惕成是α2锹ββ掀'σ3.表达拌过程原核洞生物真核邪生物无细寨胞核钉，转炎录和贤翻译右几乎腔同时气进行刑，基这因表蒸达的然调控森主要疫发生咱在转改录水窄平。有细达胞核妈，转猴录在纺细胞来核中胞，翻墙译在戒细胞语质中医，并棋且转辅录和愚翻译坏后都仪有加债工过禾程，板基因甩表达楼的调穷控可殊以发萌生在粉各种胆不同羽水平珠。4.表达雕的调挎控（1）真胳核生妈物的粒表达逆调控信号吩转导转录捐因子信号愿分子受体剧分子离子茧通道第二胡信使伤分子蛋白篮激酶坑或磷首酸酯抬酶活饺性转录瓜因子基因耀表达（2）原野核生车物的用表达席调控①代谢脸物对学基因牌活性誓的调介节可诱减导调毙节是指粒一些酒基因张在特理殊的堡代谢再物或带化合袜物的胀作用胡下，撤由原蔬来关秋闭的旷状态许转变穿为工店作状赌态，胆即在级某些哗物质召的诱悟导下蝴使基窝因活另化。可阻铃遏调畜节中的嫌基因畜平时拔都是炊开启溉的，嚼处在前产生犁蛋白划质和壳酶的谦工作熟过程羡中，草但由逐于一四些特淋殊代推谢物途或化鹅合物畜的积灾累将截其关窑闭，启阻遏随了基愧因的厕表达欠，所爆以称钥为可淡阻遏说基因要。②弱化萄因子盯对基摔因活升性的罩影响③降解总物对春基因梯活性宴的调饥节添加业葡萄无糖能量数得到戒满足细菌冠的腺视苷酸愈环化速酶抑制环腺耕苷酸(cM煮AP)↓cA达MP＋受虚体蛋咬白↓调控键的基便因就坛不表扫达④细菌尖的应闭急反吵应氨基念酸饥碎饿空载tR切NA鸟苷损四磷谎酸（pp他Gp匆p）鸟苷寸五磷进酸（pp骂pG粪pp）关闭幕一些慨基因迎的表坟达开启衔氨基贯酸合锐成基怖因的疏表达生产疲各种RN挪A、糖积、脂助肪和猛蛋白富质在碎内的亡几乎守全部与生物被化学磁反应虎过程椅均被轧停止⑤环腺舰苷酸签受体吉蛋白沫对转樱录的女调控葡萄阿糖缺躁乏cA钉MP合成↑cA烧MP受体诸蛋白促进RN怒A聚合娃酶结握合一蓄些基惩因的啊启动害子抑制RN驳A聚合尝酶结签合一通些基职因的司启动芝子总结基因遇工程严操作涂中应置注意网的真稿核生蛙物与按原核岂生物对的差脖异1.基因梦结构粮的差闹异2.启动搜子和RN套A聚合纠酶的致差异3.蛋白美质的扒翻译题后修奥饰加视工（屿前体觉切割侍、二价硫键策、糖笔基化砖、甲劫基化锋、羰内基化垮、磷揉酸化砍、乙描酰化鸣、硫蝇酸化蜂、丙晕烯酸勿化、朗豆冠诉酸化奇、软光脂化绵）4.基因沙表达努的调昆节（馒表达今量）5.载体肢的差升异6.蛋白棍质的骄纯化城方便1．遗辰传密喂码与社信息炮流毒储存红在DN渴A上的卸遗传澡信息侵通过mR懒NA传递嚷给蛋梳白质假，mR耐NA与蛋雪白质逼之间林的联落系是河通过惩遗传代密码皱的破意译来怀实现渔的。mR坦NA上每3个核篮苷酸抵翻译糟成蛋缴白质考多肽担链上演的一址个氨忽基酸臭，这3个核持苷酸评就称疯为密廉码子版，也旺叫三仙联子傻密码防。蛋曲白质昨是通牺过遗饲传信串息流不由基坛因控矿制的畅。三摆基因赶研究贞进展2．结摩构基火因和讽调节末基因结构尺基因(s扭tr守uc概tu僻ra影l炊ge请ne症)是可航以转稿录成膛为各奇种RN苹A(如rR酿NA、tR倍NA、sn秘RN则A)直接属行使障功能馅，或屋者转皆录成麻信使RN先A(铲mR祸NA)然后俭翻译便成多喘肽链厉，最枣终形迟成各沸种功累能蛋坡白质冠和酶芦。热从才广义摩上讲蹈，任躬何一鸦种能糖够调疯节或牛限制爱其他楼基因貌活性价的基每因都筹可叫互做调节标基因(r匠eg偏ul肺at枝or辽y著ge格ne袖)，一经般情犬况下撑则是丘指基零因产稼物参慢与调株节别行的基晒因活缴性的浊基因(如阻袭遏基梢因等)。首沙先转蚁录成mR捉NA，然液后由mR酱NA翻译立成阻懒遏蛋袭白质酬或激骡活蛋苏白质掩，通税常也蜂称为转录邻因子或反渗式作漏用因茧子。案它们眨通常犯结合企到结病构基款因的益非编吓码区膏的顺世式元填件上令起调阁控作滨用。3．管色家基丈因和邪奢侈风基因手具有棵相同磨遗传螺信息偏的个钞体细运胞间戚其所祥利用鹿的基尿因并蒸不相吩同，芬有的屡基因羞活动擦是维用持细织胞基劫本代周谢所浸必需痕的，腰而有顾的基害因则制在一先些分饺化细象胞或体受到析外界堪刺激叔的细罪胞中阿活动指。前错者称库为管家摄基因(h贱ou怜se狭-k耐ee鞭pi势ng坛g泽en太e)，如汽编码舞核糖忌体蛋欢白、里线粒技体蛋屡白、牢糖酵裙解酶笑等的晓基因雨；而卖后者州被称雁为奢侈恒基因(1振ux躁ur读y河ge筝ne葵)，4．移盗动基惠因19贝67年在孟大肠广埃细改菌的遮乳糖询操作银子的野研究喊中第监一次绿发现栽了称届为插入张序列(i间ns芬er菠ti云on叮s凯eq拐ue效nc继e，IS傻)的转筒座因坑子。卫直至19适80年夏爆皮罗(S奏ha专pi惧ro虽)等人及证实篮了可泡移位梦的遗糊传基驾因存率在，揉说明另某些舰基因柏具有疤移动谈性。转座远子也称滥易位亭子，幼是由气两个肯重复盲顺序评夹着镇一个锦或多朗个结神构基唤因组携成。碎有的撤转座饶子的氏重复变序列珍就是IS。转伸座子重也和IS一样挥，能烛从一帮个位言点转分座到骑另一舒个位许点，尝或从圆一个共复制穷子转坚座到培另一交个复笼制子务。转监座子亿属于斯可移臂动的马遗传属因子—移动帽基因除。除栗了转寇座因股子外诱，病违毒和放质粒筋都是栗染色敬体外属的可记以移暖动的朴遗传披物质摇，都价必须钻依赖裳宿主爆而复末制。5．重罚叠基介因禁核苷沃酸序如列是由彼此搂重叠扫的两食个基蝴因称侨为重叠财基因(o很ve话rl隆ap哲pi妹ng稠g蒜en周es屑)或镶新嵌基译因(n赛es朱te购d弃ge芳ne钥s)。6．假佩基因假基内因是多杂基因龟家族网中的证成员卖，因页其碱振基顺任序发桃生某侮些突消变而是失去秃功能钥，不败能表技达或末表达睬异常滑，生循成无爪生物够活性数的多呀肽。假基镰因DN择A顺序圾可在楼相应博基因叼名称昨之前暗加φ表示闭，如α珠蛋配白基杜因家滔族中φξ1与功蜻能性ξ2基因障同源赵，φξ1有3个碱元基被脊取代成，其品中密阁码子6的GA盼G—胆TA率G(谷氨扩酸→终止仆密码)发生吓无义狮突变营。例如塔，在究珠蛋型白、粒免疫督球蛋蚊白、引组织戚相容讯性抗脂原(h丧is饼to匙co劝mp翅at是ib迹i1直it遣y指an权ti管ge厘n)以及悠肌动苏蛋白腐和微洗管蛋丘白等具基因疾家族(g乓en摸e砖fa誓mi糟ly秒)中，总都存傻在着帜这样麻的功负能失去活的飘假基蚁因。(1盯)重复员的假萌基因许多城假基共因都成是同互“亲把本基若因”(P挪ar到en毕ta盲l8计en桂e)连锁杂的，台而且员同其乎编码锁区及粱侧翼索序列棍的DN肺A具有醉很高炎的同俊源佳分。可堂见产遗生此橡种类傲型的春假基鹿因拷离贝的挤一种除可能秧的机蝴理是饮，由您含有蛋“亲秆本基震因”腥的染格色体节区段腹串联虾重复朋形成救，故棚称之捆为重产复的庭假基丧因。披珠蛋宴白基粪因家萍族中铸的假忌基因瓣即属根于这属一种豆类型调。(2乏)加工为的假押基因除了犁重复销的假漫基因孤外．亭在真击核生定物的身染色拍体基殿因组饭中还掠存在叼着一灵类加驾工的被假基盾因(p懒ro叮ce为ss远edps振eu述do条ge鼓ne)。这债类假饼基因讲没有弯与“沈亲本剩基因涉”连骡锁，澡而且悄其结球构是满同转立录本室而非予“亲或本基绕因”萌类似龟。例摘如，余它们倚都没鸦有启矿动子慌和间肆隔子仇，但煎在基俩因的3’恩—末端袋则都逃有一凉段延锋伸的崭腺嘌唤呤短杀序列哭，恰舌似mR透NA分子3’申—末端械的po药ly册(A)尾巴扮。这屠些特合征表祝明，夫此类迫假基甜因很证可能菊是来融自加勇工的RN橡A之DN爆A拷贝补，因碰此称道之为加工瘦的假暗基因。7．串印联基简因簇托中度次重复DN标A有许枣多类藏型的含重复蒙序列屠组成暂。多陷重复眯序列析组成尾的基漂因簇晚在重眨复区诉域的恢下游廊出现凉，这筛些通翁常是候其产哀物需哀求量刚很高俭的基冬因，rD腔NA(编码rR享NA)就是酷其中浮一例橡。编摔码18冲S、5.亮8S和28条Sr院RN部A的45饰S前体弄的基猪因就衬有约10～10塔00街0个拷赛贝的命重复贫序列让，其挂拷贝降数因嫂物种块而异馒。人畏类基岗因组希中45请S基因拘在5个不潮同的留染色挺体上浙都有祝排列从，每久一排李列包质含约40个拷润贝。作在分裳裂间女期这粒些区锦域都混处于年核仁志区，物核仁弓是细皂胞核杀中的谎致密吴区域均，是rR矩NA合成难和修梦饰的脚工厂勾。另睬一个野串联姿基因课簇的隐例子和是组壳蛋白零基因慰，其私产物变在S期大撑量产颜生，5种组蛋情白基剥因在贺一个热基因士簇，炭有的混可直协接重喜复达返数百耍次。8．基饰因组忽基浆因组(g配en炕om骨e)是19管24年提宝出的佩，是非指一疗个生冷物体触、细晌胞器革或病两毒的表全部玩基因遇。原杠核生稼物基岗因组墓仅由仙一条里环状酱的双歪链DN尾A分子附组成攻，含或有一崖个复厦制起稳点，鲁它的林基因嚼组就先是它扣的整薪个染克色体贝。但辞对于旗二倍遥体的贝高等达生物岩，能迎维持肿配子完体正悟常功呜能的处最低闻数目舌的一末套染冰色体插构成搬的一壁个基踩因组餐。对副于植瞒物细咏胞而驾言，遇则有3个基援因组饮，即染色象体基科因组(核基菠因组)、线粒卵体基污因组和叶绿丸体基动因组。(1开)原核姓生物价基因芬组的者特点原核慰生物呜基因醋组的悬特点友包括为：①具有报操纵屠子结听构；②编码赞序列窝在基够因组训中约凶占50％，柏远大拜于真吩核基庆因组另，但光又小兽于病晚毒基卡因组劝，编佛码顺拨序不心重叠龙，其溜转录嫌产物光多为头多顺断反子辫结构蹲；③多顺挡反子手结构羽且无乓内含怀子，没是连携